肝細胞肝癌門靜脈癌栓相關蛋白質組研究.pdf

1、研究背景：肝細胞肝癌是我國最常見的腫瘤之一，隨著治療方法和影像技術水平的提高，早期肝癌切除術后的五年生存率已達50％-75％，但肝癌伴有門靜脈癌栓預后很差，其中位生存期僅為2.7月，而肝癌無門靜脈癌栓患者的中位生存期達24.4個月。肝細胞肝癌容易侵犯肝內血管特別是門靜脈，癌栓易于在主瘤附近的門靜脈血管內形成，約有30％-60％的肝癌病人常常伴有門靜脈癌栓。門靜脈癌栓的特征迫切需要我們了解其發(fā)生的分子機制，找到治療肝癌伴門靜脈新的的方法，

2、發(fā)現(xiàn)門靜脈癌栓分子學標記物，從而為臨床治療提高新的靶點。 肝癌的發(fā)生發(fā)展是由多基因參與、多步驟協(xié)同的復雜過程。盡管所有的細胞都擁有同樣的基因組，但在不同的細胞內會有不同的基因處在活躍狀態(tài)，從而合成不同的蛋白質。同樣，不同細胞的差異在很大程度上也是由功能基因及其合成蛋白質的不同來決定的，因而需要在整體水平上分析肝癌細胞內蛋白的動態(tài)變化。隨著后基因組時代的到來，以雙向電泳、質譜分析為主的蛋白質組學的方法和手段為腫瘤研究提供了良好的技

3、術平臺，蛋白質組研究直接定位于蛋白質水平，從整體、動態(tài)、定量的角度去研究腫瘤發(fā)生過程中蛋白質種類、數(shù)量的改變。不僅有助于進一步揭示腫瘤的發(fā)病機制，亦有助于發(fā)現(xiàn)能進行早期臨床診斷的腫瘤標記物(biomarker)。 本研究通過雙向電泳的方法研究肝癌原發(fā)灶與門靜脈癌栓之間蛋白表達的差異，探討這些差異蛋白在肝癌門靜脈轉移過程中的作用。從而尋找到作為門靜脈癌栓形成的標記物和治療門靜脈癌栓新的靶點。 材料和方法：1.材料收集200

4、5年1月至2005年6月間東方肝膽外科醫(yī)院的肝癌伴門靜脈癌栓手術患者的手術標本5例。 2.方法收集標本都經(jīng)-80℃液氮凍存，組織經(jīng)研磨后加入裂解液，超聲裂解，高速離心(15000轉/分)1小時后收集上清液，Bradford法測定蛋白濃度。雙向電泳：經(jīng)等一相電聚焦電泳(非線性pH3-10)和二相十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，用雙胺銀染法(分析膠)和考馬斯亮藍(制備膠)染色。掃描獲取圖象，用PDQuest

5、7.0軟件進行斑點檢測和匹配分析。差異蛋白點切膠，膠上酶解，抽提酶解肽段，ZipTip脫鹽，MALDI-TOF質譜，軟件分析數(shù)據(jù)，鑒定出差異蛋白質。Westernblot驗證差異蛋白的表達。 結果: 1.原發(fā)灶和門靜脈癌栓標本進行2次2-DE以保證試驗的重復性共獲得各組20塊2D膠圖譜，蛋白表達譜均類似，多集中分布于pI4-9間的區(qū)域。 2.用PDQuest7.0軟件將蛋白圖譜分成2個類別進行點的鑒定.原發(fā)灶組平

6、均點數(shù)1350±78，癌栓組點數(shù)1230±53。 3.參考膠進行兩組之間的匹配分析，篩選出在超過2例以上，灰度均存在2倍以上的差異點20個。 4.通過質譜分析和NCBI數(shù)據(jù)鑒定結果：包括膜聯(lián)蛋白A5(AnnexinV)、分泌性外源性血凝結素1(Glactin1)、過氧化物還原酶1(peroxiredoxin1)、細胞核增殖抗原(PCNA)、高遷移率族蛋白框1(HMBG1)等在內的20個差異蛋白。 5.Wester