狂犬病毒感染的神經(jīng)細胞差異蛋白質(zhì)組學研究及伴侶素CCTγ的功能分析.pdf

1、狂犬病毒(Rabies virus，RV)屬于彈狀病毒科狂犬病毒屬的單股不分節(jié)段的負鏈RNA病毒，具有高度嗜神經(jīng)性和致死性?；蚪M全長約為12kb，分別編碼糖蛋白(G)、核蛋白(N)、基質(zhì)蛋白(M)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)。目前對該病毒與宿主細胞相互作用的機制認識相對有限，致病機制仍不甚明了。本研究對RV感染的宿主細胞差異表達蛋白進行分析，旨在為探討RV對宿主細胞的致病作用和尋找潛在的藥物靶標奠定基礎。
　　 單克隆抗體是疾

2、病診斷、預防、治療以及免疫機制研究的有力武器，除商業(yè)化的糖蛋白單克隆抗體，無針對RV其他蛋白的單克隆抗體。本研究將RV核蛋白重組表達載體pET32a-NP和糖蛋白重組表達載體pET32a-GP分別誘導表達，用變性純化的表達蛋白免疫BALB/c小鼠，成功制備了9株抗RV核蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞和1株抗RV糖蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞。同時，通過以自制的狂犬病毒感染乳鼠腦組織懸液為抗原免疫小鼠，取脾細胞與sp2/0細胞融合，成功獲得了7株

3、為抗RV磷蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞。
　　 為了探索病毒與宿主細胞的相互作用，本研究選擇鼠成神經(jīng)瘤細胞N2a為感染模型，采用二維凝膠電泳技術結(jié)合質(zhì)譜鑒定的經(jīng)典比較蛋白組學方法，分析了N2a細胞在感染RV后24h、48h和96h的差異蛋白表達譜。PDQuest軟件分析結(jié)果顯示，RV感染N2a細胞后，共出現(xiàn)了97個差異表達的蛋白點，差異表達的蛋白點主要出現(xiàn)在感染后48h和96h，且多數(shù)蛋白點呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢。串聯(lián)質(zhì)譜MALDI-T

4、OF/TOF對差異蛋白點進行鑒定，成功鑒定出對應49種差異蛋白的53個蛋白點。這些差異蛋白的功能涉及蛋白合成與加工、能量代謝、信號轉(zhuǎn)導、應激反應/伴侶蛋白、基因調(diào)控、免疫反應和泛素——蛋白酶體通路。設計引物，并通過適時熒光定量PCR對其中的27個差異蛋白對應基因轉(zhuǎn)錄本的變化進行了驗證，一定程度上確證了質(zhì)譜鑒定結(jié)果的可靠性。免疫印跡實驗驗證了HSP90和CCTγ在感染組和對照組中上調(diào)表達的差異。針對差異表達蛋白，基于Ingenuity生物

5、網(wǎng)絡分析軟件IPA繪制了這些差異蛋白的相互作用網(wǎng)絡。上述差異表達蛋白信息和蛋白相互作用網(wǎng)絡為進一步解析狂犬病發(fā)病機制提供了重要的蛋白組學信息。
　　 依據(jù)比較蛋白組學信息，采用間接免疫熒光雙標技術進一步分析了RV感染細胞CCTα、CCTβ、CCTγ、HSP90、PFDN1和DLC8的亞細胞分布。結(jié)果表明，病毒感染引起了細胞CCTα和CCTγ蛋白在內(nèi)氏小體部位的高度募集，PFDN1和DLC8在該部位的部分聚集，CCTα和CCTγ與

6、病毒N、P蛋白能夠很好的共定位;而CCTβ和HSP90則無明顯的內(nèi)氏小體部位募集現(xiàn)象。共轉(zhuǎn)染RVN和P的細胞內(nèi)也形成類似內(nèi)氏小體的結(jié)構(gòu)，且在該結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)與感染細胞類似的現(xiàn)象，CCTγ、CCTα、PFDN1和DLC8與內(nèi)氏小體中N、P蛋白發(fā)生共定位。單獨轉(zhuǎn)染N或P的細胞中也出現(xiàn)不同程度的CCT和CCTα與N或P的共定位。熒光定量結(jié)果表明感染細胞中DLC8、CCTγ和HSP90均呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄上調(diào)，而CCTα、CCTβ、PFDN1則變化不明顯;

7、而P質(zhì)粒單轉(zhuǎn)以及與N質(zhì)粒共轉(zhuǎn)N2a細胞引起了DLC8的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，這可能與P和DLC8的相互作用有關，而其他蛋白則變化不顯著。這都說明，這些宿主細胞蛋白主動或被動的參與了病毒的生命活動。
　　 鑒于CCTγ在蛋白組學上的表達差異及亞細胞定位上的分布變化，有必要對其在狂犬病毒生命周期中的具體功能進行探索。本研究通過慢病毒介導的shCCTγ、shCCTα和無義序列shcoo2v的轉(zhuǎn)導建立了穩(wěn)定表達shCCTγ、shCCTα的RNA