大鼠原代系膜細(xì)胞亞細(xì)胞組分的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、背景與目的：蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是指在一個(gè)細(xì)胞的整個(gè)生命過程中由基因組表達(dá)的以及表達(dá)后修飾的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)可以通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的研究，真實(shí)的反映機(jī)體內(nèi)環(huán)境的情況，揭示疾病的發(fā)病機(jī)理，為疾病早期診斷提供特異性的標(biāo)志物。細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組是最近新發(fā)展起來的蛋白質(zhì)組學(xué)，通過研究細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，可以明確蛋白質(zhì)的具體定位，以及蛋白質(zhì)在不同亞組分中的轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞功能的關(guān)系，對(duì)于闡明細(xì)胞的功能調(diào)控機(jī)制有非常重要的

2、作用。系膜細(xì)胞是腎小球的基本組成細(xì)胞之一，許多腎小球腎炎如糖尿病腎病、IgA腎病等都能夠引起系膜細(xì)胞的異常。本研究通過研究正常系膜細(xì)胞亞組分的蛋白質(zhì)組學(xué)，建立系膜細(xì)胞亞組分蛋白質(zhì)表達(dá)譜，初步分析各組分蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，揭示蛋白質(zhì)調(diào)控系膜細(xì)胞功能的作用機(jī)制。
　　 方法：(1)大鼠的原代系膜細(xì)胞的分離提取和鑒定：利用篩網(wǎng)技術(shù)，首先得到純化的腎小球，經(jīng)Ⅳ型膠原酶消化，獲得原代系膜細(xì)胞，培養(yǎng)至8-10代。vimentin、desmi

3、n免疫熒光鑒定系膜細(xì)胞。(2)分離提純系膜細(xì)胞亞組分蛋白質(zhì)：利用碧云天細(xì)胞亞組分抽提試劑盒分離提純系膜細(xì)胞漿蛋白、細(xì)胞膜蛋白、細(xì)胞核蛋白。western blot檢測(cè)MDH1、Na-K-ATPase、TBP在各組分中的表達(dá)。(3)膠內(nèi)酶解：蛋白質(zhì)經(jīng)10％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，將各亞組分電泳條帶膠塊切割成12段，并用胰蛋白酶酶解。(4)質(zhì)譜鑒定：采用UPLC-QTOF(Waters公司)液相質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，采用protein

4、 Lynx Global Serverversion2.4進(jìn)行數(shù)據(jù)處理軟件，最后用NCBI大鼠數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。(5)生物信息學(xué)分析：利用BINGO軟件對(duì)各亞組分蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞成分分析，采用博奧公司的MAS軟件分析各亞組分的蛋白質(zhì)生物學(xué)功能。(6)細(xì)胞骨架定位的驗(yàn)證：利用免疫熒光和Western blot驗(yàn)證SEPT2和F-Actin的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)系膜細(xì)胞鑒定：免疫熒光結(jié)果顯示，vimentin、desmin在系膜細(xì)

5、胞胞漿里表達(dá)，證明提取細(xì)胞為系膜細(xì)胞；(2)細(xì)胞亞組分純度驗(yàn)證，WesternBlot結(jié)果顯示：MDH1在細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，Na-K-ATPase在細(xì)胞膜和細(xì)胞核表達(dá)均有，TBP在細(xì)胞核與細(xì)胞漿內(nèi)均由表達(dá)。證明各亞組分取其它組分污染。(3)亞組分蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析：共鑒定出細(xì)胞漿蛋白993個(gè)，其中新發(fā)現(xiàn)細(xì)胞漿蛋白292個(gè)；細(xì)胞膜蛋白647個(gè)，其中新發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜蛋白382個(gè)；細(xì)胞核蛋白740個(gè)，其中新發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核蛋白451個(gè)。這些亞組分蛋白質(zhì)

6、協(xié)同參與調(diào)控細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、代謝進(jìn)程、轉(zhuǎn)錄與翻譯、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及應(yīng)激等生物功能。(4)細(xì)胞骨架蛋白蛋白F-Actin和SEPT2的驗(yàn)證。Wesetern blot和免疫熒光結(jié)果顯示，F(xiàn)-Actin和SEPT2在細(xì)胞漿蛋白、細(xì)胞膜蛋白、細(xì)胞核蛋白均有表達(dá)，與質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)一致。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)采用了SDS-PAGE/LC-MS技術(shù)，成功的獲取了各亞組分的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)了新的亞組分蛋白質(zhì)。這些亞組分蛋白質(zhì)協(xié)同參與了生物