利用GroEL基因和dsRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因番茄抗TYLCV的研究.pdf

1、番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是江蘇省主要蔬菜作物，在蔬菜周年供應(yīng)中占有很重要的地位。然而近年來，番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）的發(fā)生，對番茄植株的生長、開花、坐果等方面產(chǎn)生了嚴重的危害，嚴重影響了番茄生產(chǎn)的品質(zhì)和產(chǎn)量，給番茄產(chǎn)區(qū)的生產(chǎn)造成了巨大了損失。
　　 番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），并通過煙粉虱（

2、Bemisia tobaci）傳播。目前國內(nèi)開展抗TYLCV的研究時間尚短，可用的抗源有限。由于TYLCV不同物種間的遺傳隔離、病毒重組變異引起的雙生病毒基因組多樣性以及抗源在不同地區(qū)的表現(xiàn)差異，使抗病育種受到了極大限制。因此在利用常規(guī)技術(shù)和生物技術(shù)進行發(fā)病規(guī)律、抗病機理和抗源篩選研究的同時，本實驗利用轉(zhuǎn)基因手段，希望獲得抗TYLCV的番茄材料。
　　 本實驗利用煙粉虱內(nèi)共生菌GroEL基因構(gòu)建了具有抗生素標記的SUC2-Gro

3、EL和無抗生素標記的CaMV35S-PDRB10兩個植物表達載體，同時還利用番茄黃化曲葉病毒的AC1（replication-relate）和AC2（movement）基因構(gòu)建了反向重復(fù)序列表達載體。經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄，對轉(zhuǎn)基因番茄進行了抗病研究，研究結(jié)果如下：
　　 1.具有抗生素標記的SUC2-GroEL和無抗生素標記的CaMV35S-PDRB10兩個植物表達載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化獲得抗性再生苗。對抗性植株進行PCR、R

4、T-PCR以及病毒檢測，PCR結(jié)果表明：SUC2-GroEL載體和CaMV35S-PDRB1O載體的陽性植株分別有11株和9株。RT-PCR結(jié)果顯示：SUC2-GroEL載體和CaMV35S-PDRB10載體分別有6株和2株檢測到GroEL基因特異條帶，說明GroEL基因在轉(zhuǎn)錄水平得到表達。經(jīng)農(nóng)桿菌病毒接種和帶毒煙粉虱傳毒檢測后，結(jié)果顯示SUC2-GroEL載體的3、4和5號植株和CaMV35S-PDRB10載體的5號植株均未表現(xiàn)發(fā)病癥

5、狀，證明利用GroEL基因抗番茄黃化曲葉病毒具有可行性，而且SUC2啟動子誘導(dǎo)的GroEL抗性更加理想。
　　 2.利用TYLCV的AC1（replication-relate）和AC2（movement）基因構(gòu)建了反向重復(fù)序列植物表達載體pBI121-AC1-AC2經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化導(dǎo)入番茄，獲得再生植株。經(jīng)PCR、注射接種和煙粉虱傳毒實驗檢測，PCR檢測顯示：獲得13株陽性植株，表明目的基因已經(jīng)整合到番茄基因組DNA中。進一步進行