轉(zhuǎn)基因番茄外源基因檢測(cè)方法研究.pdf

1、近年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展引起了人們關(guān)注。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為解決人類的食物短缺等問題帶來了福音，然而其引發(fā)的合理性和安全性問題亦成為關(guān)注的焦點(diǎn)。針對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的安全性和合理性，建立健全轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)方法體系顯得很迫切，尤其是探索一套經(jīng)濟(jì)便捷的檢測(cè)體系更是當(dāng)前科研工作的重點(diǎn)。自第一例轉(zhuǎn)基因植株培育成功以來，轉(zhuǎn)基因作物種類不斷增多，番茄作為世界性的蔬菜，針對(duì)其性狀和質(zhì)量改良的轉(zhuǎn)基因品系也相繼商品化進(jìn)入市場。我國是番茄進(jìn)出口大國，所以針對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄

2、建立一套番茄轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法體系是有必要的。
　　 本文以兩個(gè)陽性樣品華番一號(hào)和麗春番茄，陰性對(duì)照樣品合作903和一個(gè)購自市場的隨機(jī)抽檢樣品為檢測(cè)對(duì)象，分別采用傳統(tǒng)定性PCR技術(shù)、核酸斑點(diǎn)雜交以及微流體芯片技術(shù)，對(duì)上述樣品進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)的外源基因選擇轉(zhuǎn)基因番茄中慣用的35S（花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子）、NOS（胭脂堿合成酶終止子），NPTⅡ(新霉素轉(zhuǎn)移酶基因)，35S-EFE(35S和番茄EFE基因的交聯(lián)結(jié)構(gòu))、內(nèi)參基因選擇番茄La

3、t52（花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子），mcpi（金屬羧肽酶），fru（β-呋喃果糖苷酶），apx（抗壞血酸過氧化物酶）。
　　 研究中首先采用傳統(tǒng)定性PCR技術(shù)和核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)，檢測(cè)了外源基因35S、NOS、NPTⅡ、35S-EFE和內(nèi)參Lat52基因。選用質(zhì)粒PBI121為陽性對(duì)照、合作903番茄為陰性對(duì)照。華蕃一號(hào)樣品中4個(gè)外源基因和1個(gè)內(nèi)參基因均成功檢出，陽性質(zhì)粒PBI121中只有35S、NOS、NPTⅡ基因被檢出，陰性對(duì)照番茄

4、合作903中只有內(nèi)參基因Lat52檢出。試驗(yàn)重復(fù)性良好，檢測(cè)靈敏度高，兩種方法相互補(bǔ)充，排除假陽性可能。核酸斑點(diǎn)雜交一次可檢出多個(gè)外源基因，增加了檢測(cè)數(shù)量，為我國番茄轉(zhuǎn)基因檢測(cè)提供參考。
　　 其次本研究將普遍運(yùn)用于基因表達(dá)譜分析等領(lǐng)域的微流體基因芯片技術(shù)運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因番茄檢測(cè)，搜索報(bào)道的轉(zhuǎn)基因番茄基因信息，設(shè)計(jì)了895條針對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄的外源基因和內(nèi)參基因的寡聚核苷酸探針，每條探針4個(gè)重復(fù)，原位合成轉(zhuǎn)基因番茄微流體檢測(cè)芯片。分別采

5、用普通PCR-CY3標(biāo)記、（二次擴(kuò)增）多重PCR-CY3標(biāo)記和隨機(jī)引物-CY3標(biāo)記三種CY3標(biāo)記方案將熒光信號(hào)滲入番茄DNA，以華番一號(hào)為樣本進(jìn)行芯片雜交檢測(cè)，比較了三種標(biāo)記方案的標(biāo)記效果。選取標(biāo)記效果較好的普通PCR-CY3標(biāo)記和多重PCR-CY3標(biāo)記方法分別對(duì)陽性品種麗春番茄進(jìn)行芯片檢測(cè)試驗(yàn)。并用普通PCR-CY3標(biāo)記的方法檢測(cè)了陰性番茄品種合作903以及隨機(jī)抽檢的市場品種黃色圣女果番茄。芯片檢測(cè)結(jié)果表明:普通PCR-CY3標(biāo)記、（

6、二次擴(kuò)增）多重PCR-CY3標(biāo)記體系較適合芯片檢測(cè)樣品處理，而隨機(jī)引物標(biāo)記方法沒得到較好的標(biāo)記效果。從華番一號(hào)、麗春番茄樣品中檢出了35S啟動(dòng)子、NOS終止子、35S-EFE交聯(lián)結(jié)構(gòu)基因、NPTⅡ標(biāo)記基因以及番茄的4個(gè)內(nèi)參基因fru、apxmcpi、Lat52的多數(shù)探針信號(hào)，四次重復(fù)平均信號(hào)值良好，偏差小，信號(hào)值較高。合作903番茄的芯片上只有內(nèi)參基因探針檢出信號(hào)，而圣女果番茄中不僅檢測(cè)到番茄內(nèi)參基因探針信號(hào)，4個(gè)外源基因的探針均有探針