基于dsRNA的煙草和番茄抗雙生病毒基因工程研究.pdf

1、雙生病毒(geminiviruses)引起的病害在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，在我國(guó)其引起的番茄曲葉病發(fā)生面積大、發(fā)展迅速、危害嚴(yán)重。但是目前我國(guó)對(duì)該類病害還缺乏有效的控制策略。RNA沉默是近年發(fā)現(xiàn)的植物對(duì)病毒的自然抗性機(jī)制，利用RNA沉默技術(shù)進(jìn)行植物抗雙生病毒基因工程研究，有望獲得廣譜高抗的轉(zhuǎn)基因植物，為有效控制這類病毒病害奠定基礎(chǔ)。
　　 本文利用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行番茄和普通煙抗雙生病毒基因工程研究，以在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出RNA沉默的高

2、效誘導(dǎo)因子dsRNA為目標(biāo)，將引起我國(guó)番茄曲葉病害的3種主要雙生病毒番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl virus，TYLCV)、臺(tái)灣番茄曲葉病毒(Tomato leaf curl Taiwan virus，ToLCTWV)和中國(guó)番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)的部分復(fù)制酶基因以反向重復(fù)的方式與擬南芥內(nèi)含子相連，并定向插入到植物表達(dá)載體p

3、BIN438上35S啟動(dòng)子下游;以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄和煙草。目前獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草，并對(duì)這種轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了抗病性測(cè)定。用TYLCV接種47株TO代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草，癥狀觀察和TAS-ELISA檢測(cè)表明，不同TO代轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TYLCV的抗性程度不同。轉(zhuǎn)化番茄實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中.為了能更好的控制番茄曲葉病害的發(fā)生，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)TYLCV的部分rep基因構(gòu)建反向重復(fù)植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化普通煙和番茄，目前已獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)SH2hp-rep普通煙TO代

4、27株，對(duì)TYLCV的抗性正在測(cè)定中.番茄轉(zhuǎn)化還在進(jìn)行中.
　　 另外，本文利用滾環(huán)擴(kuò)增（RCA技術(shù)在云南采集的89個(gè)樣品中，發(fā)現(xiàn)一種與云南煙草曲葉病毒（Tobacco leaf curl Yunnan virus，TbLCYnV）伴隨的重組缺陷型小分子.該小分子大小為754bp，含有大多數(shù)nanoviruses中保守的九核苷酸TAGTATTAC和TYLCCNV衛(wèi)星betasatellite的衛(wèi)星保守區(qū)的互補(bǔ)序列，不編碼蛋白。致