羥自由基在抑制ParA1誘導煙草過敏反應中作用的初步研究.pdf

1、蛋白類激發(fā)子elicitins是一類由卵菌綱的疫霉屬和腐霉屬真菌分泌的小分子蛋白，在非親和性植物與疫霉、腐霉互作中起著重要的作用。低濃度elicitins就可以誘導煙草產(chǎn)生過敏反應（hypersensitive response，HR），并進一步誘導煙草產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性等生物學效應，研究認為elicitins誘導的細胞死亡不需要氧爆發(fā)參與。Parasiticein（ParAl）是由寄生疫霉分泌的elicitin類激發(fā)子，外源表達Par

2、Al注射煙草，也可以產(chǎn)生相同的生物學效應。因此，外源表達并獲得單一有活性的ParAl蛋白可以用于研究植物-病原真菌互作。
　　 核黃素是一種重要的水溶性維生素。核黃素和其衍生物可以作為輔基參與生物許多以氧化-還原為特征的生理生化反應。此外它還是一種光敏物質，可以被紫外光誘發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)核黃素和三線態(tài)核黃素，作為電子供體與氧氣分子結合形成活性氧如超氧陰離子、過氧化氫等。活性氧在植物中也具有很重要的作用。當植物受到病原菌侵染后，氧爆發(fā)

3、是植物響應病原菌侵染的最早期事件之一，產(chǎn)生的活性氧參與細胞壁加固、脂質氧化、防衛(wèi)基因激活及防衛(wèi)信號傳遞等一系列重要生理過程。本實驗室發(fā)現(xiàn)在光照條件下核黃素與ParAl共同注射可以抑制ParAl誘導的煙草HR，本研究主要對此現(xiàn)象的產(chǎn)生機制做初步解析。
　　 1.ParAl蛋白在畢赤酵母中的表達
　　 為了獲得單一有活性的ParAl蛋白，本實驗室首先采用表達效率比較高的原核表達系統(tǒng)，但是表達的ParAl蛋白產(chǎn)量較低，不足以進

4、行后續(xù)試驗。根據(jù)已有研究，我們采用真核蛋白表達系統(tǒng)-畢赤酵母表達ParAl蛋白。我們首先構建蛋白胞內表達和胞外表達兩種重組質粒（pPICZ（α）A系列），將重組質粒和相應的空載體由電擊轉化到野生型菌株X-33和突變菌株KM71H中，進行蛋白表達。通過對不同轉化子的蛋白預表達和活性檢驗，結合后續(xù)蛋白純化過程，我們選擇KM71H轉胞內表達載體為最后蛋白表達系統(tǒng)。經(jīng)過鎳柱純化，我們在蛋白電泳圖譜中得到了單一、清晰的蛋白電泳條帶，且蛋白濃度約為

5、75 ng/μl。在煙草上注射表達純化的蛋白觀察HR表型，結合蛋白電泳，我們認為此蛋白即是表達的目的蛋白，而且具有較高的生物學活性，稀釋6000倍后仍可以在煙草上引發(fā)HR。
　　 2.核黃素抑制ParAl誘導的煙草過敏反應
　　 核黃素和ParAl共同注射煙草葉片，在持續(xù)光照24 h后，發(fā)現(xiàn)核黃素抑制ParAl在煙草上誘導的細胞死亡。檢測核黃素注射到煙草葉片并光照1.5 h后注射位置的H2O2含量，發(fā)現(xiàn)該位置的H2O2含

6、量是空白對照的約1.4倍，DAB染色得到相似結論。不同活性氧清除劑與ParAl和核黃素共同注射，catalase，抗壞血酸和還原型谷胱甘肽可以恢復核黃素對HR的抑制作用，而超氧化物歧化酶則不能恢復；但是外源H2O2與ParAl共注射，對HR的抑制效果不明顯。進一步用羥自由基清除劑硫脲、腺嘌呤和組氨酸分別與ParAl和核黃素共同注射煙草葉片，都可以恢復核黃素對HR的抑制；同時外源羥自由基可以抑制ParAl誘導的HR。因此我們初步認為羥自由