羥自由基在抑制ParA1誘導(dǎo)煙草過(guò)敏反應(yīng)中作用的初步研究.pdf

1、蛋白類(lèi)激發(fā)子elicitins是一類(lèi)由卵菌綱的疫霉屬和腐霉屬真菌分泌的小分子蛋白，在非親和性植物與疫霉、腐霉互作中起著重要的作用。低濃度elicitins就可以誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR），并進(jìn)一步誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性等生物學(xué)效應(yīng)，研究認(rèn)為elicitins誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡不需要氧爆發(fā)參與。Parasiticein（ParAl）是由寄生疫霉分泌的elicitin類(lèi)激發(fā)子，外源表達(dá)Par

2、Al注射煙草，也可以產(chǎn)生相同的生物學(xué)效應(yīng)。因此，外源表達(dá)并獲得單一有活性的ParAl蛋白可以用于研究植物-病原真菌互作。
　　 核黃素是一種重要的水溶性維生素。核黃素和其衍生物可以作為輔基參與生物許多以氧化-還原為特征的生理生化反應(yīng)。此外它還是一種光敏物質(zhì)，可以被紫外光誘發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)核黃素和三線態(tài)核黃素，作為電子供體與氧氣分子結(jié)合形成活性氧如超氧陰離子、過(guò)氧化氫等?；钚匝踉谥参镏幸簿哂泻苤匾淖饔?。當(dāng)植物受到病原菌侵染后，氧爆發(fā)

3、是植物響應(yīng)病原菌侵染的最早期事件之一，產(chǎn)生的活性氧參與細(xì)胞壁加固、脂質(zhì)氧化、防衛(wèi)基因激活及防衛(wèi)信號(hào)傳遞等一系列重要生理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)在光照條件下核黃素與ParAl共同注射可以抑制ParAl誘導(dǎo)的煙草HR，本研究主要對(duì)此現(xiàn)象的產(chǎn)生機(jī)制做初步解析。
　　 1.ParAl蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)
　　 為了獲得單一有活性的ParAl蛋白，本實(shí)驗(yàn)室首先采用表達(dá)效率比較高的原核表達(dá)系統(tǒng)，但是表達(dá)的ParAl蛋白產(chǎn)量較低，不足以進(jìn)

4、行后續(xù)試驗(yàn)。根據(jù)已有研究，我們采用真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)-畢赤酵母表達(dá)ParAl蛋白。我們首先構(gòu)建蛋白胞內(nèi)表達(dá)和胞外表達(dá)兩種重組質(zhì)粒（pPICZ（α）A系列），將重組質(zhì)粒和相應(yīng)的空載體由電擊轉(zhuǎn)化到野生型菌株X-33和突變菌株KM71H中，進(jìn)行蛋白表達(dá)。通過(guò)對(duì)不同轉(zhuǎn)化子的蛋白預(yù)表達(dá)和活性檢驗(yàn)，結(jié)合后續(xù)蛋白純化過(guò)程，我們選擇KM71H轉(zhuǎn)胞內(nèi)表達(dá)載體為最后蛋白表達(dá)系統(tǒng)。經(jīng)過(guò)鎳柱純化，我們?cè)诘鞍纂娪緢D譜中得到了單一、清晰的蛋白電泳條帶，且蛋白濃度約為

5、75 ng/μl。在煙草上注射表達(dá)純化的蛋白觀察HR表型，結(jié)合蛋白電泳，我們認(rèn)為此蛋白即是表達(dá)的目的蛋白，而且具有較高的生物學(xué)活性，稀釋6000倍后仍可以在煙草上引發(fā)HR。
　　 2.核黃素抑制ParAl誘導(dǎo)的煙草過(guò)敏反應(yīng)
　　 核黃素和ParAl共同注射煙草葉片，在持續(xù)光照24 h后，發(fā)現(xiàn)核黃素抑制ParAl在煙草上誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。檢測(cè)核黃素注射到煙草葉片并光照1.5 h后注射位置的H2O2含量，發(fā)現(xiàn)該位置的H2O2含

6、量是空白對(duì)照的約1.4倍，DAB染色得到相似結(jié)論。不同活性氧清除劑與ParAl和核黃素共同注射，catalase，抗壞血酸和還原型谷胱甘肽可以恢復(fù)核黃素對(duì)HR的抑制作用，而超氧化物歧化酶則不能恢復(fù)；但是外源H2O2與ParAl共注射，對(duì)HR的抑制效果不明顯。進(jìn)一步用羥自由基清除劑硫脲、腺嘌呤和組氨酸分別與ParAl和核黃素共同注射煙草葉片，都可以恢復(fù)核黃素對(duì)HR的抑制；同時(shí)外源羥自由基可以抑制ParAl誘導(dǎo)的HR。因此我們初步認(rèn)為羥自由