雞miR-2954超表達(dá)載體的構(gòu)建及其性腺發(fā)育相關(guān)靶基因的研究.pdf

1、禽類與哺乳動(dòng)物均屬于遺傳性別決定，但與哺乳動(dòng)物不同，禽類的性別決定機(jī)制還不確定，上游性別決定因子還有待于進(jìn)一步探尋。研究表明在轉(zhuǎn)錄后起重要調(diào)控作用的miRNAs在動(dòng)物性腺發(fā)育過程有重要作用，本課題組擬從miRNA水平尋找與雞性別決定及早期性腺發(fā)育相關(guān)的上游調(diào)控因子。miR-2954是位于禽類Z染色體上的miRNA，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其在雄性性腺及其他組織中的表達(dá)量顯著高于雌性，與先前報(bào)道的在其他禽類中的研究結(jié)果相似，這提示了miR-2

2、954可能作為一個(gè)細(xì)胞自主決定因子在雞早期性別決定及性腺發(fā)育中起調(diào)控作用。本研究首先構(gòu)建了miR-2954超表達(dá)載體，并結(jié)合基因的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證了miR-2954與性腺發(fā)育及功能相關(guān)靶基因的調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步確定及研究miR-2954在雞早期性腺發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.制備了不同性別原代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，通過定量PCR檢測miR-2954在不同CEF細(xì)胞及商品化DF1細(xì)胞中的表達(dá)量，結(jié)

3、果顯示miR-2954在雄性CEF細(xì)胞中的表達(dá)量最高，并極顯著地高于雌性和混樣（雌雄等量混合）CEF及商品化DF1細(xì)胞，這與miR-2954雄性高表達(dá)特性相符;且結(jié)果表明本室的商業(yè)化DF1細(xì)胞適用于后續(xù)的miR-2954超表達(dá)載體效果檢測及靶基因驗(yàn)證研究。
　　2.構(gòu)建了PSIN-2954、PSIN-eGFP-2954和PSIN-eGFP三種表達(dá)載體，通過序列測定和轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光觀察初步確定其效果。定量PCR檢測結(jié)果顯示miR-2

4、954在轉(zhuǎn)染了PSIN-2954和PSIN-eGFP-2954載體的細(xì)胞中表達(dá)量均顯著提高，這表明miR-2954超表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　3.轉(zhuǎn)染PSIN-2954載體后通過PI染色法檢測miR-2954對(duì)DF1細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-2954組G1期的細(xì)胞比例呈極顯著降低，而S期和G2期的細(xì)胞則極顯著升高，這表明miR-2954的超表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　4.根據(jù)雞轉(zhuǎn)錄組的mRNA(包括5'UTR、CDS

5、和3'UTR)與miR-2954序列的匹配情況與功能分析，篩選出四個(gè)與雞性腺發(fā)育及功能相關(guān)的基因AMH、DMRT1、SF1及VLDL作為miR-2954的候選靶基因，并成功的構(gòu)建了靶序列的熒光素酶報(bào)告重組載體。
　　5.候選靶基因(AMH、DMRT1、SF1和VLDL)的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，miR-2954可顯著或極顯著地降低SF1和VLDL-CDS雙熒光素酶的活性，而AMH和DMRT1-CDS雙熒光素酶活性無明顯變化