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文檔簡介
1、目的:
腫瘤的遷移和侵襲是多基因參與、多步驟完成的復(fù)雜生命現(xiàn)象,其發(fā)生的隱蔽性和不可預(yù)測(cè)性是腫瘤患者治療過程中最重要的難題,也是威脅腫瘤患者生命的最重要原因。目前,對(duì)于其發(fā)生機(jī)制的研究已取得了很多的成就,microRNA(miRNA)的發(fā)現(xiàn)又使這一領(lǐng)域的研究有所擴(kuò)展。miRNA屬于小RNA分子家族,能通過與3'非翻譯區(qū)(3'UTR)帶有互補(bǔ)序列的靶基因互補(bǔ)結(jié)合,引起靶基因mRNA的降解或翻譯抑制,從而發(fā)揮對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控
2、作用。研究表明,miRNA的調(diào)節(jié)作用涵蓋了生長發(fā)育,細(xì)胞凋亡,造血細(xì)胞分化,脂肪代謝等多種生命過程。在腫瘤組織中,也存在miRNA的差異表達(dá),提示人們miRNA可能參與腫瘤的某些生物學(xué)特性的形成。此研究的目的即探尋是否miRNA參與了肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控過程,這一調(diào)控過程是通過哪些基因?qū)崿F(xiàn)的。
方法:
本實(shí)驗(yàn)室的前期工作表明miR-10a是抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要miRNA,其可能是通過調(diào)節(jié)MMP14的表
3、達(dá)來發(fā)揮作用。為了研究miR-10a對(duì)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響,我們進(jìn)行了深入的研究。細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)中,過表達(dá)或封閉掉miR-10a后,細(xì)胞的遷移及侵襲能力發(fā)生了變化。同時(shí)用MTT,平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-10a對(duì)細(xì)胞活性及增殖能力的影響。在確認(rèn)miR-10a與肝癌細(xì)胞遷移及侵襲表型相關(guān)之后,我們通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其靶基因,挑選了其中一個(gè)與腫瘤轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)的靶基因EPHA4為研究對(duì)象。在接下來的實(shí)驗(yàn)中,我們構(gòu)建了帶
4、有EPHA4的3'UTR miR-10a靶位點(diǎn)的報(bào)告基因載體,在肝癌細(xì)胞系中檢測(cè)miR-10a對(duì)報(bào)告基因表達(dá)水平的影響,來驗(yàn)證EPHA4是否為miR-10a的靶基因。此后,又通過Real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)了miR-10a對(duì)EPHA4的mRNA和蛋白水平的影響。構(gòu)建的質(zhì)粒pSilenser/EPHA4-shRNA對(duì)細(xì)胞表型的影響,進(jìn)一步驗(yàn)證EPHA4是否為miR-10a的靶基因。
結(jié)果:
5、r> 細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,過表達(dá)miR-10a能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲,封閉掉miR-10a能降低肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,且并不影響細(xì)胞的活性及增殖能力。報(bào)告基因載體實(shí)驗(yàn)表明miR-10a能夠抑制帶有EPHA4靶位點(diǎn)的報(bào)告基因表達(dá)載體的表達(dá)。Real-time PCR和Western blot的結(jié)果表明miR-10a能夠影響EPHA4的mRNA和蛋白水平。pSilenser/EPHA4-shRNA質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞表型的影響
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