與海島棉纖維發(fā)育相關(guān)AG-subfamily和MYB類轉(zhuǎn)錄因子的功能研究.pdf

1、棉花是重要的經(jīng)濟作物,能夠為紡織工業(yè)提供紡織纖維。棉纖維從胚珠外表皮細胞發(fā)育而來,其發(fā)育過程包括纖維細胞起始、延伸、次生壁合成、以及纖維成熟4個彼此重疊的時期。依據(jù)花發(fā)育的“ABCDE”模型,C-,D-lineage基因?qū)儆贏G-subfamily類轉(zhuǎn)錄因子并調(diào)控胚珠和子房發(fā)育,這兩種花器官均是構(gòu)成棉花纖維產(chǎn)量的決定因素。纖維發(fā)育過程是一個涉及劍眾多基因作用的復(fù)雜過程,盡管人們對纖維發(fā)育機制還不完全清楚,但一系列與棉纖維發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

2、已經(jīng)被分離出來,其中MYB類轉(zhuǎn)錄因子對人們揭開纖維發(fā)育機制起重要作用?；贏G-subfamily和MYB類轉(zhuǎn)錄因子在纖維發(fā)育中的重要性,從胚珠絹織中克隆并分析這兩類轉(zhuǎn)錄因了有望為利用分子育種技術(shù)提高棉花產(chǎn)量和質(zhì)量提供候選基因。
　　 通過RACE策略從+3 DPA時期的胚珠組織中共分離到2個AG-subfamily轉(zhuǎn)錄因子和3個MYB類轉(zhuǎn)錄因子的全長cDNA,分別命名為GbAGL1(登錄號:FJ198049)、GbAGL2(臀

3、錄號:FJ198050)、GbMYB1(瞀錄號:FJ198051)、G6MYB2(登錄號:FJ198052)和GbMYB3(登錄號:FJ198053)。進而通過Southern雜交、RT-PCR、RNA原位雜交、實時定量PCR、轉(zhuǎn)基因擬南芥研究了這些基因的特征和表達模式。
　　 GbAGL1基因cDNA全長為951bp,包括1個長度為672 bp的ORF,1個長度為67 bp的5’端非翻譯區(qū)和1個長度為212 bp的3’非翻譯區(qū)

4、,編碼1個由223個氨基酸組成的多肽(蛋白序列號:AC123560),分子量為25.72 kDa,等電點pI為9.44。GbAGL1基因蛋白包括1個MADS-box(2-56)、1個K-box(91-157)和2個AGmotifs,即AG motifⅠ(194-206)和AG motifⅡ(211-223)。GbAGL1基因和D-lineages高度同源,表明該基因是D-lineage基因,可能和胚珠發(fā)育有關(guān)。Southernblot分

5、析表明該基因在海島棉中以低拷貝形式存在。RT-PCR分析表明GbAGL1基因在胚珠組織中高水平表達,但在根、莖和葉等部位表達很低,并且從-3 DPA到+8 DPA時期的轉(zhuǎn)錄信號有規(guī)律地逐漸增強。RNA in situ hybridization結(jié)果顯示GbAGL1基因在整個花芽原基、胚珠外表皮和纖維部位高水平轉(zhuǎn)錄。GbAGL1在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的超表達分析顯示,GbAGL1基因和其它D-lineage基因具有類似功能,改變了擬南芥花器官發(fā)

6、育表型。這些結(jié)果表明GbAGL1基因和胚珠發(fā)育有關(guān),可能在纖維發(fā)育中起作用。
　　 GbAGL2基因cDNA全長為1098 bp,包括1個長度為735 bp的ORF,1個長度為110 bp的5’端非翻詳區(qū)和1個長度為252 bp的3’非翻譯區(qū),編碼1個由244個氨基酸組成的多肽(蛋白序列號:AC123561),分子量為28.12 kDa,等電點pI為9.34。GbAGL2基因蛋白包括1個MADS-box(17-71)、1個K-b

7、ox(105-171)和2個AGmotifs,即AG motifⅠ(214-226)和AG motifⅡ(232-244)。GbAGL2基因和C-lineages高度同源,表明該基因是C-lineage基因,可能和心皮發(fā)育有關(guān)。Southernblot分析表明該基因存海島棉中以低拷貝形式存在。RT-PCR結(jié)果分析表明GbAGL2基因在胚珠內(nèi)表達,在根、莖和葉等部位表達相對較低。RNA in situ hybridization結(jié)果顯示G

8、bAGL2基因在心皮原基、胚珠外表皮和纖維細織中均高水平表達。GbAGL2在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的超表達分析顯示,GbAGL2基因和其它的C-lineage基因具有類似功能,改變了擬南芥花器官表型。這些結(jié)果表明GbAGL2基因和心皮發(fā)育有關(guān),可能在纖維發(fā)育中有提高纖維產(chǎn)量的作用。
　　 GbMYB1基因cDNA全K為974 bp,包括1個長度為765 bp的ORF,1個長度為66 bp的5’端非翻譯區(qū)和1個長度為143 bp的3‘非翻

9、譯區(qū),編碼1個由254個氨基酸組成的多肽(蛋白序列號:ACI23562),分子量為29.07 kDa,等電點pI為6.25。GbMYB1基因蛋白包含2個MYB重復(fù)序列(14-61,67-112)。GbMYB1和R2R3-MYB類蛋白高度同源,表明該基因?qū)儆赗2R3-MYB類型基因,可能在海島棉中和纖維發(fā)育有關(guān)。Southern blot分析表明該基因在海島棉中以低拷貝形式存在。RT-PCR分析表明GbAGL1基因在胚珠組織中均高水平表達

10、,但在根、莖和葉等部位表達很低,并且從-3 DPA到+8 DPA時期的轉(zhuǎn)錄信號有規(guī)律地逐漸增強。Real-timePCR結(jié)果和RT-PCR結(jié)果一致,GbMYB1基因在徐州-142(wt)胚珠中的表達量(ΔCT值)高于在徐州-142無絮突變體(fl)中的表達量。RNA in situ hybridization結(jié)果顯示GbMYB1基因在胚珠外表皮和纖維部位高水平轉(zhuǎn)錄。GbMYB1基因存轉(zhuǎn)基因擬南芥中的過量表達使其表型發(fā)生了改變,如葉片變窄

11、、矮化、根系核果長度有所縮短等。
　　 GbMYB2基因cDNA全長為979 bp,包括1個長度為747 bp的ORF,1個長度為163 bp的5’端非翻譯區(qū)和1個長度為72 bp的3’非翻譯區(qū),編碼1個由248個氨基酸組成的多肽(蛋白序列號:ACI23563),分子量為28.09 kDa,等電點pI為8.99。GbMYB2蛋白包含2個MYB重復(fù)序列(25-72,78-123)。GbMYB2和R2R3-MYB類蛋白高度同源,表明

12、該基因?qū)儆赗2R3-MYB類型基因。Southern blot分析表明該基因在海島棉中以低拷叭形式存在。RT-PCR分析表明GbMYB2基因在胚珠和其它組織中均有表達。Real-time PCR結(jié)果顯示從-3 DPA到+12 DPA時期,GbMYB2基因表達量(ΔCT值)呈現(xiàn)由低到高的規(guī)律性變化,GbMYB2存徐州-142(wt)肝珠中的表達量高于在徐州-142無絮突變體(fl)中的表達量。RNA in situ hybridizati

13、on結(jié)果顯示GbMYB2基因存胚珠外表皮和纖維部位高水平轉(zhuǎn)錄。GbMYB2基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的過量表達使其表型發(fā)生了改變,如葉片變得寬大與褶皺、葉表皮毛有所增多、根系加長、開花期有所延遲等。
　　 GbMYB3基因cDNA全長為1129 bp,包括1個長度為795 bp的ORF,1個長度為73 bp的5’端非翻譯區(qū)和1個長度為271 bp的3’非翻譯區(qū),編碼1個由264個氨基酸組成的多肽(蛋白序列號:ACI23564),分子量

14、為29.63 kDa,等電點 pI為9.12。GbMYB3基因蛋白包含2個MYB蘋復(fù)序列(14-61,67-112)。GbMYB3和R2R3-MYB類蛋白高度同源,表明該基因?qū)儆赗2R3-MYB類型基因。Southern blot分析表明該基因在海島棉中以低拷貝形式存在。RT-PCR分析表明GbMYB3基因在胚珠和其它組織中均有表達。Real-time PCR結(jié)果顯示從-3 DPA到+12 DPA時期,GbMYB3基因表達量(ΔCT值)