海島棉ERF族B3和B1亞組轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與特征研究.pdf

1、棉花是重要的經(jīng)濟作物，各種病害特別是黃萎病嚴重影響著棉花生產(chǎn)，基因工程技術(shù)的發(fā)展為棉花抗病育種提供了新途徑。ERF族轉(zhuǎn)錄因子通過ERF域和GCC-box等順式元件相互作用，調(diào)控下游基因如病程相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄過程，從而改變植物抗病、抗逆性狀，在植物抵抗生物和非生物脅迫中扮演重要角色。ERF族轉(zhuǎn)錄因子分為不同組類，其中B3亞組成員通過上調(diào)啟動子中含有GCC-box元件基因的轉(zhuǎn)錄活性，增強植物體抗病性，而B1亞組轉(zhuǎn)錄因子對啟動子中含有GCC

2、-box基因的轉(zhuǎn)錄活性起抑制作用，具有防止下游基因過度激活的功能?？寺∵@兩亞組基因、探究其生物學功能，對農(nóng)作物抗病性狀的遺傳改良具有重要意義。
　　 為了克隆與棉花黃萎病抗性相關(guān)的B3/B1亞組轉(zhuǎn)錄因子基因，本研究首先利用陸地棉EST庫進行電子克隆，獲得20個B3亞組和9個B1亞組陸地棉ERF族基因。然后根據(jù)海島棉和陸地棉的同源性及ERF族轉(zhuǎn)錄因子的保守性，以黃萎病處理的海島棉幼苗cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴增出29個具有完

3、整閱讀框的同源基因，其中27個是第一次從海島棉分離出的新基因。利用實時熒光定量技術(shù)，對大麗輪枝菌孢子液處理的海島棉幼苗根組織中各基因轉(zhuǎn)錄本量分析發(fā)現(xiàn)：GbB3002、GbB3003、GbB3009、GbB3016-20，GbB1006，GbB1007等多個基因明顯增加，上調(diào)幅度在7倍以上；GbB3012和GbB3015兩個基因只有處理前的三分之一左右；GbB3010基本沒有變化；其它基因雖有上升，但上調(diào)幅度較小，都在5倍以下。利用RAC

4、E技術(shù)擴增基因的5’-和3’-UTR，獲得4個基因全長cDNA序列，分別命名為GbEREB3(GbB1007，)、GbEREB4(GbB1006)，GbEREB5(GbB3009)和GbEREB6(GbB3015)，并提交到NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，注冊號分別是JN003806，JN003807，JN003808，JN003809。
　　 在利用生物信息學對4個基因分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建GFP瞬時表達載體轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞進行亞

5、細胞定位分析，結(jié)果表明四個轉(zhuǎn)錄因子均分布于核內(nèi)；利用BL21(DE3)原核表達菌株，表達GST和轉(zhuǎn)錄因子融合蛋白，純化后進行凝膠阻滯實驗，證明它們和GCC-box能夠特異結(jié)合；構(gòu)建超表達載體轉(zhuǎn)化煙草，對T0代植株進行半定量和熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，GbEREB3/4和GbEREB5/6在轉(zhuǎn)基因陽性植株中均得到異位表達，而防衛(wèi)基因NtCHI-B和NtPR2的轉(zhuǎn)錄本量相應地減少和增加，該結(jié)果表明GbEREB3/4和GbEREB5/6分別具有下調(diào)和

6、上調(diào)NtCHI-B和NtPR2基因轉(zhuǎn)錄活性的功能，暗示這些基因參與防衛(wèi)反應過程。另外，構(gòu)建超表達載體將B1亞組(Gb)EREB2(GbB1004)基因轉(zhuǎn)入陸地棉，實時熒光定量分析表明T0陽性棉株中幾丁質(zhì)酶(CHI)和β-1，3-葡聚糖苷酶(BGL)基因的轉(zhuǎn)錄活性下降；測量GbEREB2轉(zhuǎn)基因陽性棉株的離體葉片失水率發(fā)現(xiàn)比受體葉片更容易失水，表明GbEREB2基因不僅參與棉花的防衛(wèi)反應過程，而且與植物的水分代謝生理過程密切相關(guān)。