雞傳染性喉氣管炎病毒單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立.pdf

1、傳染性喉氣管炎(Infectious Laryngotracheitis，ILT)是由傳染性喉氣管炎病毒(InfectiousLaryngotracheitis Virus，ILTV)引起雞的一種呼吸道疾病，具有高度的傳染性，在世界各地均有流行。該病可引起病雞呼吸困難、咳出血樣分泌物，產(chǎn)蛋率下降甚至死亡。研制簡便、快速、準(zhǔn)確的診斷方法對ILT的防治至關(guān)重要。本研究制備了抗ILTV gB、gD蛋白的單克隆抗體，建立了ILTV雙抗體夾心EL

2、ISA抗原檢測方法，為ILT的快速檢測和診斷提供了一種有效的手段。
　　首先利用原核表達(dá)的ILTV gB、gD蛋白為抗原分別免疫6-8周齡的BALB/c小鼠，取血清抗體效價大于104的免疫小鼠脾臟制備的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合;利用間接ELISA方法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞克隆，最終獲得能穩(wěn)定分泌抗ILTV gB和gD蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株各2株，分別命名為5A8、1C1、4D6和7D9。制備腹水后，用protein G層

3、析柱純化腹水;利用間接ELISA方法對純化后的腹水進(jìn)行抗體效價測定，4株雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水效價都大于1∶105; Western Blot試驗(yàn)結(jié)果表明，4株單抗都能與其相應(yīng)的蛋白特異性識別;間接免疫熒光試驗(yàn)檢測結(jié)果表明，4株單抗均可與感染ILTV的LMH細(xì)胞產(chǎn)生特異性熒光反應(yīng)。
　　然后，進(jìn)一步利用交叉配對法對單抗及酶標(biāo)單抗進(jìn)行試驗(yàn)，最終確定以ILTV單克隆抗體7D9作為包被抗體，以酶標(biāo)抗體7D9-HRP作為檢測抗體，建立了IL

4、TV雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法。試驗(yàn)反應(yīng)條件優(yōu)化為:單克隆抗體包被濃度為5μg/mL，4℃包被過夜;用1％BSA封閉液封閉，37℃孵育120 min;待檢抗原37℃孵育60 min;酶標(biāo)抗體工作濃度為2.5μg/mL，37℃孵育60 min。該方法與禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)均無交叉反應(yīng)，檢測ILTV最低病毒量為102TCID50/mL，該方法在批次內(nèi)、批間內(nèi)的變異系數(shù)均小于8％。用建