結(jié)核分枝桿菌Rv3627c基因的克隆表達(dá)與功能分析.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁是維持其生長和增殖的重要結(jié)構(gòu)，主要由分枝菌酸、阿拉伯聚糖半乳聚糖和肽聚糖（mycolic acid-arabinogalactan-petidoglycan，mAGP）三部分組成，其中肽聚糖是細(xì)菌生長所必需的。青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）參與肽聚糖的合成和維護(hù)，因此，鑒定結(jié)核分枝桿菌中的青霉素結(jié)合蛋白，有助于了解肽聚糖的代謝機(jī)理。 我們通過生物信息學(xué)的方法

2、和細(xì)菌之間的相似性預(yù)測結(jié)核分枝桿菌基因組中的Rv3627c基因的表達(dá)產(chǎn)物為可能的PBPs，其結(jié)構(gòu)兩次跨膜，并且可能具有羧肽酶或內(nèi)肽酶的活性，參與肽聚糖的重建和多肽鏈之間的交聯(lián)，有可能成為新的潛在的抗結(jié)核藥物作用靶點(diǎn)。為了分析結(jié)核分枝桿菌中基因Rv3627c的功能，我們設(shè)計(jì)此課題進(jìn)行研究：首先克隆結(jié)核分枝桿菌的Rv3627c基因，然后分別在大腸桿菌BL21（DE3）、C41（DE3）和恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegma

3、tis，Sm）中表達(dá)重組蛋白，并設(shè)計(jì)酶促反應(yīng)分析該蛋白質(zhì)的功能。 目的：（1）通過PCR的方法從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的基因組DNA中擴(kuò)增出Rv3627c基因；（2）分別構(gòu)建pET29b-Rv3627c和pVV16-Rv3627c表達(dá)載體；（3）分別在大腸桿菌BL21（DE3）、C41（DE3）和恥垢分枝桿菌mc2155中表達(dá)Rv3627c蛋白；（4）分析Rv3627c蛋白是否具有羧肽酶活性。 結(jié)果： 1．R

4、v3627c基因的克隆 從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株基因組數(shù)據(jù)庫（http：//genolist．pasteur．fr/TubercuList/）中獲得Rv3627c基因的核苷酸序列（1395 bp）。根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計(jì)上下游PCR引物，并分別在其上游引物和下游引物的5’端引入了NdeⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)。以H37Rv菌株基因組DNA為模板擴(kuò)增出了Rv3627c基因。 將Rv3627c基因克隆到pMD18載體，并

5、對(duì)Rv3627c進(jìn)行DNA序列測定。結(jié)果顯示所克隆的Rv3627c基因與H37Rv菌株基因組數(shù)據(jù)庫中Rv3627c基因的核苷酸序列完全一致，說明在本次實(shí)驗(yàn)中通過PCR的方法獲得的Rv3627c基因?yàn)檎_擴(kuò)增的基因，無堿基突變。 2．pET29b-Rv3627c的構(gòu)建及Rv3627c蛋白在大腸桿菌中的表達(dá) 用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切pMD-Rv3627c，將Rv3627c基因克隆到表達(dá)載體pET29b。在pET29b-Rv

6、3627c中，Rv3627c蛋白的C端與質(zhì)粒上的組氨酸標(biāo)簽形成融合蛋白。 用pET29b-Rv3627c質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3），并加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。用SDS-PAGE鑒定了誘導(dǎo)表達(dá)的Rv3627c蛋白。 用pET29b-Rv3627c質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌C41（DE3）的感受態(tài)細(xì)胞，用0．1 mM IPTG在37℃誘導(dǎo)C41（DE3）/pET29b-Rv3627c細(xì)菌3小時(shí)。超聲破碎細(xì)菌后對(duì)上清和

7、沉淀組分進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明Rv3627c蛋白在大腸桿菌C41（DE3）中被誘導(dǎo)表達(dá)。通過組氨酸-Ni2+親和層析技術(shù)純化Rv3627c蛋白，對(duì)純化的Rv3627c蛋白進(jìn)行定量（考馬斯亮藍(lán)法），第1洗脫組分中Rv3627c蛋白濃度為1．03 mg/ml，并通過SDS-PAGE鑒定純化的Rv3627c蛋白。 3．pVV16-Rv3627c表達(dá)載體的構(gòu)建及Rv3627c蛋白在恥垢分枝桿菌mc2155中的表達(dá) 用

8、NdeⅠ和HindⅢ雙酶切pMD-Rv3627c，將Rv3627c基因克隆到表達(dá)載體pVV16。用pVV16-Rv3627c表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化mc2155感受態(tài)細(xì)胞。挑選6個(gè)單菌落接種到5 ml含Kan（25mg/ml）和Tween80（終濃度0．05%）的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，然后大體積培養(yǎng)mc2155p/VV16-Rv3627c細(xì)菌。收集、超聲破碎細(xì)菌，對(duì)上清和沉淀組分進(jìn)行了SDS-PAGE分析，但無預(yù)期的蛋白條帶

9、。 4．Rv3627c蛋白的酶活性分析 提取mc2155p/VV16-Rv3627c及野生型mc2155細(xì)胞壁中的胞壁肽作為底物，設(shè)計(jì)了酶促反應(yīng)。利用紙層析方法檢測反應(yīng)生成的產(chǎn)物。通過結(jié)果推斷結(jié)核分枝桿菌Rv3627c基因表達(dá)的蛋白質(zhì)可能具有羧肽酶活性。 結(jié)論：在本次研究中，我們分別構(gòu)建了pET29b-Rv3627c和pVV16-Rv3627c表達(dá)載體，并分別在大腸桿菌BL21（DE3）和C41（DE3）表達(dá)了R