番茄Cf-4和Cf-9基因介導的過敏性反應調控基因的篩選和鑒定.pdf

1、番茄(Solanum lycopersicum)與葉霉病菌(Cladosporium fulvum)互作符合基因對基因假說，是研究植物與病原互作的模式系統(tǒng)，番茄抗C.fulvum基因(Cf)和葉霉菌的無毒基因(Avr)產物識別后激活下游抗病信號傳導，活化各類防衛(wèi)反應基因的表達，最終表現抗病性。目前對Cf下游信號傳導途徑的了解還很膚淺。本研究聯合采用蛋白質組學分析技術和快速反向遺傳學基因功能分析技術——病毒誘導的基因沉默(virus in

2、ducedgene silencing，VIGS)，篩選和鑒定番茄Cf-4和Cf-9介導的過敏性反應調控基因，獲得了以下主要研究結果： (1)建立了一套適于番茄子葉總蛋白分離的雙向電泳分析技術體系。通過對雙向電泳中幾個重要因素，包括上樣量、IPG膠條選擇、上樣方式、聚焦條件等的優(yōu)化，總結出可以獲得高分辨率、高重復性結果的雙向電泳操作體系：使用TCA/丙酮沉淀方法提取番茄子葉總蛋白，采用24cmpH3-7NL的IPG膠條，水化上樣

3、，300μg的上樣量，低電壓除鹽后8000v56000～68000vhs進行等電聚焦。 (2)開展了番茄抗葉霉病蛋白質組學分析。通過雙向電泳分析，分別獲取了Cf-4(HR-)、Avr4/Cf-4(HR+)、Cf9(HR-)及Avr9/Cf-9(HR+)基因型番茄苗的蛋白質組圖譜。對四種基因型番茄的蛋白質組圖譜的比較分析結果表明，66個蛋白在Cf-4(HR-)與Avr4/Cf-4(HR+)基因型番茄苗中差異表達，其中59個蛋白在A

4、vr4/Cf-4基因型番茄苗(HR+)中表達量上調，7個下調；71個蛋白在Cf-9(HR-)與Avr9/Cf-9(HR+)基因型番茄苗中差異表達，其中59個蛋白在Avr9/Cf-9基因型番茄苗(HR+)中表達量上調，12個下調。Avr9/Cf-9和Avr4/Cf-4這兩個互作中均差異表達的蛋白有43個，其中39個在Avr9/Cf-9(HR+)和Avr4/Cf-4(HR+)基因型番茄苗中表達上調，4個表達下調。同時分離得到僅在Avr9/C

5、f-9(HR+)和僅在Avr4/Cf-4(HR+)基因型番茄苗中差異表達蛋白，分別為23個和28個， 差異表達蛋白點切取后進行MALDI-TOF-MS和MALDI-TOF/TOF-MS質譜分析和數據庫檢索分析，65個蛋白得到成功鑒定。這些差異表達蛋白功能主要涉及防衛(wèi)反應、信號傳導、代謝、蛋白合成、轉錄調控和光合作用等方面。 (3)采用VIGS技術分析了19個差異表達蛋白對應基因的抗病功能。對差異表達蛋白的序列進行了分析，

6、65個蛋白編碼基因中的19個可以在本氏煙或煙草序列數據庫中搜索到氨基酸序列一致率68％以上或編碼的核酸序列一致率80％以上的同源基因。選取這19個本氏煙或煙草同源基因作為沉默的靶標基因，對其在抗病性中的作用進行了檢測分析。采用RT-PCR擴增克隆目的基因片段，并亞克隆至煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)基因沉默載體，在本氏煙上進行TRV誘導的VIGS分析，檢測沉默植株的抗病性表現。發(fā)現蛋白酶體20Sβ亞基、

7、內質網網眼結合蛋白(Luminal-binding protein5，BiP5)、細胞分化蛋白酶ftsH同源物(Cell division protease ftsH homolog)、促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinasel，MAPK1)、天冬酰胺合成酶(Asparagine synthetase，AS)、ASR4(Abscissic acid，Stress,Ripening)、葉綠體噻

8、唑生物合成蛋白(Chloroplast thiazole biosynthetic protein)等7個基因沉默后植株表現出壞死、矮化，葉片和花器發(fā)育畸形等癥狀。AS、Pipl(phytophthora-inhibited protease 1)、MAPKl、Lemir(Lycopersicum esculentum miraculin)等4個基因的沉默顯著減弱了Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介導的HR，表明這4個基因對Cf介

9、導的HR起重要調控作用。 (4)采用VIGS技術分析了56個ACE(Avr/Cfelicited)基因的抗病功能。對56個ACE基因在本氏煙上進行TRV介導的VIGS分析，其中編碼脂轉運蛋白、病程相關蛋白、細胞色素P45076A2、細胞色素P45072A1、60S核糖體蛋白L10、bZIP轉錄調控因子BZI-2、激酶互作蛋白及一個未知功能蛋白的8個ACE基因沉默顯著減輕了Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介導的HR，表明這些

10、基因可能在Cf-4和Cf-9介導的HR中起重要調控作用。 (5)采用VIGS技術分析了8個泛素介導的蛋白降解途徑基因及2個鈣離子信號途徑基因對Cf介導HR的調控作用。結果表明1個泛素融合降解蛋白(Ubiquitinfusion degradation protein)和2個鈣離子結合蛋白(Calcium-binding protein)在Cf-4和Cf-9介導的HR中起作用。 綜上所述，本研究采用蛋白質組學方法鑒定獲取了

11、Cf-4和Cf-9介導HR產生與否差異表達蛋白，并通過VIGS方法分析了蛋白質組水平和轉錄組水平的差異表達基因在Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介導的HR中的作用，獲取了一批番茄葉霉病菌抗性調控基因。同時，這些研究結果表明結合蛋白質組學分析和VIGS技術分析的體系是篩選和鑒定植物抗病調控基因的有效技術體系，為其它功能基因的篩選和鑒定提供了借鑒。此外，研究結果增進了對番茄葉霉病抗性分子機理的理解，并為番茄葉霉病抗性品種的分子培育提供