李紅葉性狀RAPD標(biāo)記及CHS基因cDNA的克隆.pdf

1、查爾酮合酶(Chalcone Synthase，CHS)是類(lèi)黃酮合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶。CHS表達(dá)量的增加或減少都可能導(dǎo)致植物葉色的變異。本研究利用RAPD技術(shù)，篩選出與李屬(Prunus)植物紅葉性狀相連鎖的分子標(biāo)記；并采用同源克隆的方法，克隆5種李屬植物查爾酮合酶基因的cDNA序列。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.以紅葉李(P.salicina×P.atropurupurea)和安哥諾李(Prunus salicina cv.

2、‘a(chǎn)ngenuo')為雜交組合，正反交后得到56株F1代雜交苗。結(jié)合分離群體分組分析法(Bulked Segregate Analysis，BSA)，依據(jù)F1代雜交苗葉片顏色劃分出“紅葉”和“綠葉”兩個(gè)分離群體，構(gòu)建“紅葉”和“綠葉”兩個(gè)近等基因池。應(yīng)用RAPD標(biāo)記技術(shù)，用隨機(jī)引物對(duì)兩個(gè)基因池、父母本及其余F1代個(gè)體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選與李屬植物葉片紅色性狀相連鎖的分子標(biāo)記。研究結(jié)果顯示，通過(guò)對(duì)350個(gè)隨機(jī)引物的篩選，獲得一個(gè)在紅

3、葉基因池中能穩(wěn)定擴(kuò)增而在綠葉基因池中不出現(xiàn)的RAPD標(biāo)記，該擴(kuò)增條帶大小約為2 300 bp，命名為S450-2 300。經(jīng)過(guò)重復(fù)性驗(yàn)證和F1代群體單株驗(yàn)證，該標(biāo)記片段僅在紅葉個(gè)體(重組型除去)中出現(xiàn)，表明與李屬植物葉片紅色性狀相連鎖，連鎖距離為11.2 cM。
　　 2.以紅葉李、安哥諾李、黑桿櫻李(Prunus wrasifers ‘Nigra')、美人梅(Prunus×bliriana ‘Meirenmei')和紫葉李(P

4、runus cerasifera var.atropurpurea)為試材，采集不同時(shí)期的葉片，用試劑盒法提取總RNA。以O(shè)ligo(dT)為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈，并用設(shè)計(jì)的特異引物CHS-F和CHS-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，5種李屬植物各擴(kuò)增出一條大約1 200 bp的條帶，與預(yù)期的條帶大小一致。用試劑盒將目的基因片段回收后與載體pGEM-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。用上述特異引物對(duì)單

5、菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明多數(shù)為陽(yáng)性克隆菌落。將檢測(cè)為陽(yáng)性克隆的菌落送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，所得到的5種李屬植物的CHS基因cDNA序列長(zhǎng)度為1 170 bp～1 176 bp，推測(cè)的氨基酸序列長(zhǎng)度為389～391個(gè)氨基酸。CHS基因cDNA序列同源性分析表明，5種李屬植物的CHS基因之間同源性非常高，均在95％以上，其中美人梅與紫葉李之間更是高達(dá)99.3％。將序列在Genbank中Blastn，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種李屬植物與己報(bào)道的C