綠豆CHI與CHS基因的克隆與表達研究.pdf

1、黃酮類化合物是一種重要的藥用成分，不僅在植物生長發(fā)育過程中參與紫外線防護、花色形成等過程，還具有抗腫瘤、抗癌等作用。而查爾酮異構酶（CHI）和查爾酮合成酶（CHS）是黃酮類化合物合成途徑中的兩個限速酶，二者的表達與否對體內黃酮物質的合成具有關鍵的調控作用，因此，克隆出兩種酶基因，對其進行功能分析，并利用基因工程技術調控黃酮物質的合成，對提高黃酮含量、增加藥用價值或改變花色、提高花卉欣賞價值具有重要的意義，同時也可為植物黃酮類化合物合成途

2、徑的遺傳調控研究奠定基礎。
　　CHI與CHS廣泛存在于植物中，并已從多種植物中分離出這兩個酶基因。然而，綠豆作為一種富含黃酮物質的重要經濟作物，還未克隆出這兩個酶基因，因此，本研究以此為著手點，克隆出綠豆CHI與CHS基因，并將CHI基因轉化煙草和大豆，對其功能進行初步探究，具體研究結果如下：
　　1、根據(jù)其它高等植物CHI cDNA序列保守結構域設計4條引物，結合RT-PCR，以綠豆葉片cDNA為模板，采用分段克隆的方法

3、克隆出綠豆CHI基因片段，然后拼接成為具有完整ORF的序列。最后設計特異引物進行驗證，最終獲得完整ORF為669 bp的綠豆CHI cDNA全長序列，編碼222個氨基酸，經BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其在氨基酸水平上與大豆、紫花苜蓿的CHI基因同源性達到80％以上，且序列中包含查爾酮超家族以及PLN02559和查爾酮等保守結構域。
　　2、采用同源克隆的方法，克隆得到綠豆CHS基因，并利用特異引物及巢式PCR進行驗證。最終獲得綠豆CHS基

4、因家族中的3條全長cDNA序列，均為1170 bp，編碼389個氨基酸，以及1段713 bp通讀的cDNA片段。三條全長序列之間核苷酸相似性達到90%以上，均包含CHS-like結構域，經過BLAST分析，發(fā)現(xiàn)其在核苷酸水平上與菜豆、豇豆等同源性均在89%以上。
　　3、構建重組表達載體pFGC5941-CHI，并通過PCR、酶切及測序進行驗證，表明重組載體構建成功。
　　4、利用農桿菌介導法將pFGC5941-CHI重組載

5、體導入煙草和大豆，經過PCR檢測，共獲得13株煙草陽性植株，以及10株大豆陽性植株。
　　5、通過RT-PCR及涂抹除草劑實驗，證明載體上的BAR基因片段已轉入煙草和大豆中，并得到表達。涂抹除草劑實驗中發(fā)現(xiàn)轉基因植株在涂抹除草劑的一周后仍然正常生長，而非轉基因植株在涂抹除草劑的一周后枯焦死亡。此外，以CHI基因特異引物對轉基因煙草及大豆進行RT-PCR進行檢測，結果表明綠豆CHI基因在部分轉基因植株中得到表達。
　　6、提取