感染豬的腸球菌致病機(jī)制及溶血素cylA基因的原核表達(dá)研究.pdf_第1頁(yè)
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1、腸球菌(Enterococcus)是一種在自然界普遍存在的革蘭陽(yáng)性球菌,也是人和動(dòng)物腸道的主要菌群。目前,腸球菌屬的細(xì)菌種類以達(dá)到41種,但糞腸球菌(E.faecelis)和屎腸球菌仍是各種介質(zhì)中主要存在的優(yōu)勢(shì)種群。腸球菌在醫(yī)院內(nèi)細(xì)菌感染中占有重要的位置,可引起人腹膜炎、心內(nèi)膜炎、尿道炎和腦膜炎等,但近年來(lái),腸球菌對(duì)動(dòng)物感染的報(bào)道也越來(lái)越多,不但可引起羔羊的腦炎,雞和鴨的敗血癥,還可引起豬的敗血癥、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。 2003~2

2、007年期間,在河南省洛陽(yáng)、濟(jì)源、許昌、南陽(yáng)、三門峽等地送檢病豬的血液、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、腦組織、關(guān)節(jié)液等分離到42株疑似腸球菌,并通過(guò)常規(guī)和分子生物學(xué)方法鑒定到種的水平,其中糞腸球菌12株,屎腸球菌30株。為了進(jìn)一步研究腸球菌對(duì)豬感染的致病機(jī)理和為以后的免疫和血清學(xué)診斷建立基礎(chǔ),本研究又從鄭州市各集貿(mào)市場(chǎng)市售新鮮豬肉和豬糞便中分別分離了12株和14株腸球菌,對(duì)包括感染豬的42株腸球菌在內(nèi)的68株細(xì)菌進(jìn)行了毒力因子的表型和基因型

3、測(cè)定、動(dòng)物實(shí)驗(yàn),并對(duì)腸球菌的主要毒力因子cylA基因進(jìn)行克隆和原核表達(dá),所有研究?jī)?nèi)容都取得了預(yù)期的初步結(jié)果。 細(xì)胞溶解素(cyl)和明膠酶是腸球菌的兩種主要致病因子,也是臨床檢查腸球菌致病性兩個(gè)主要特征。對(duì)68株豬源腸球菌在兔鮮血平板和明膠瓊脂平板溶血和溶解情況進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)感染性菌株具有較高的比率,其中,糞腸球菌β溶血91.7%、明膠溶解100%。 cylA、gelE、efaA、esp、AS和ace被認(rèn)為是腸球菌的主

4、要致病基因,分別設(shè)計(jì)了6對(duì)引物利用PCR技術(shù)檢測(cè)了68株腸球菌的6種致病基因。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果:感染豬的腸球菌攜帶有較高比率致病基因,食品和豬糞便腸球菌攜帶的致病基因相對(duì)較低,而食品中腸球菌較糞便中腸球菌攜帶的較高:通過(guò)比較分離到的兩種腸球菌攜帶的致病基因,發(fā)現(xiàn)不管是感染豬的腸球菌,還是食品或豬糞便中腸球菌,糞腸球菌均攜帶有較高比率的致病基因。在6種致病基因中,感染豬的致病株cylA(100%)、gelE(100%)和efaA (100%)

5、檢出率最高,這說(shuō)明這三種毒力基因可能發(fā)揮主要致病作用。 動(dòng)物模型的建立是研究病原菌的致病機(jī)理、臨床治療效果、新藥開發(fā)和評(píng)價(jià)病原菌毒力大小的有效手段。腸球菌為一機(jī)會(huì)性病原體,而且其致病能力是包括了許多毒力因子在內(nèi)的復(fù)雜過(guò)程,臨床上主要通過(guò)測(cè)定其表型來(lái)判斷其毒力高低,如檢測(cè)其溶血性和明膠溶解試驗(yàn),但對(duì)于同時(shí)存在這兩種表型的菌株的毒力則無(wú)從判斷。而且由于腸球菌致病性較弱,直接用腸球菌感染小鼠往往需要較大的細(xì)菌數(shù)量,且也不易判斷不同菌株

6、致病性梯度大小關(guān)系,本研究應(yīng)用鼠糞萃取物(SRFE)按20%濃度添加到各糞腸球菌的菌液中,選擇5株攜帶有不同毒力基因糞腸球菌,通過(guò)測(cè)定各菌株的LD50,成功構(gòu)建了糞腸球菌的腹膜炎致病模型,HE1和HE5攜帶全部6種毒力基因,這兩株糞腸球菌對(duì)小鼠的LD50分別為106.01CFU和106.17CFU; HE41僅含有4個(gè)毒力基因,缺少esp和AS,HE41的LD50為107.17CFU; HE9和HE10都含有5個(gè)毒力基因,HE9缺少ac

7、e,HE10缺少AS,而它們對(duì)小鼠的LD50分別為107.01CFU和106.51CFU。 cylA是腸球菌細(xì)胞溶解素的激活蛋白基因,根據(jù)豬源腸球菌溶血素基因設(shè)計(jì)表達(dá)引物,擴(kuò)增出兩端帶有XhoⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的cylA蛋白基因,亞克隆到原核表達(dá)載體pET32a中構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-cylA,在IPTG的誘導(dǎo)下成功表達(dá),獲得了大小約為65.9 KD的融合蛋白cylA-His,與預(yù)期結(jié)果相符。為制備單抗、開發(fā)疫苗

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