豬鏈球菌溶血素基因的克隆及其原核和真核表達.pdf

1、該試驗目的是:1)檢驗豬鏈球菌分離株的生物學特性;2)建立以溶血素為靶基因的SUIS PCR檢測方法;3)構(gòu)建溶血素基因的原核和真核表達質(zhì)粒,并分析表達產(chǎn)物的免疫反應性.從臨床表現(xiàn)為腦膜炎和敗血癥的發(fā)病豬病料中分離到兩株鏈球菌,經(jīng)生化和血清學鑒定為豬鏈球菌2型,對小白鼠和家兔均具有一定的致病性.PCR能擴增出豬鏈球菌MRP、EF和溶血素三個主要毒力因子基因.根據(jù)豬鏈球菌2型溶血素基因序列設計一對引物,成功地建立了檢測豬鏈球菌溶血素基因的

2、PCR方法.用EooR I進行酶切,獲得了與預期大小一致的869bp和633bp的兩個片段;巢式PCR亦能擴增出預期片段.PCR檢測的靈敏程度可達100個細菌,對馬鏈球菌獸疫亞種、類馬鏈球菌、少酸鏈球菌、豬丹毒桿菌和豬放線桿菌等PCR檢測結(jié)果均呈陰性.結(jié)果表明該試驗建立的PCR方法特異性和敏感性均較高,可作為鍺鏈球菌病快速診斷的方法之一.采用特異性引物PCR擴增豬鏈球菌2型JX02分離株溶血素基因,將擴增產(chǎn)物克隆到pMD18-T質(zhì)粒載體

3、中,酶切和PCR鑒定后測序鑒定.結(jié)果顯示,擴增的JX02株溶血素基因長度為1494bp,編碼497個氨基酸,其N末端含有27個氨基酸的信號肽.序列分析表明,豬鏈球菌JX02株溶血素基因及其編碼產(chǎn)物屬于TACY家族,具有該家族的特征性保守序列ECTGLAWEWWR,與豬鏈球菌2型、1型、4型、8型、19型、23型和28型等菌株溶血素的氨基酸序列同源性均在99﹪以上,顯示不同血清型豬鏈球菌產(chǎn)生的溶血素無明顯差異.將溶血素基因克隆入原核表達載

4、體pBV220,重組質(zhì)粒經(jīng)鑒定后再導入減毒鼠傷寒沙門氏菌ZJ111株,提取重組質(zhì)粒進行PCR和酶切鑒定,篩選陽性克隆,用SDS-PAGE電泳和Western blot進行溶血素的表達和鑒定.結(jié)果表明,即使在體外無抗生素存在的條件下重組質(zhì)粒在受體菌ZJ111菌株內(nèi)比較穩(wěn)定,能在宿主菌中進行表達,表達產(chǎn)物具有免疫反應性.PCR擴增豬鏈球菌JX02株溶血素基因,并將其插入到真核表達載體pcDNA3的CMV啟動子下游,構(gòu)建成真核表達質(zhì)粒pcDN