2型豬鏈球菌溶血素基因(sly)的敲除及其對(duì)致病的作用.pdf

1、豬鏈球菌(streptococcussuis)是重要的人獸共患傳染病病原菌,呈世界分布,在養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家更為廣泛。由于毒力因子存在時(shí)間和空間的相對(duì)性,迄今為止,CPS為唯一得到鑒定的毒力因子,EF、MRP和suilyin(SLY)為比較公認(rèn)的毒力因子。SLY是豬鏈球菌株表達(dá)的膽固醇依賴的成孔細(xì)胞毒素,在豬鏈球菌中是唯一膽固醇依賴家族成員,是一種分泌蛋白。
　　 本研究通過(guò)構(gòu)建sly敲除載體,對(duì)2型豬鏈球菌流行毒力株05ZYH3

2、3進(jìn)行敲除。通過(guò)分析比較野生株與突變株△sly生物特性,研究了SLY的毒力功能。且對(duì)重組蛋白SLY進(jìn)行定點(diǎn)突變,獲得了具有免疫原性而無(wú)溶血活性的SLY點(diǎn)突變重組蛋白。具體結(jié)果如下:
　　 1、sIy基因的敲除及敲除突變株△sly的生物學(xué)活性分析
　　 以2型豬鏈球流行毒力菌株05ZYH33為實(shí)驗(yàn)材料,克隆sly基因的上,下游片段及氯霉素Cm抗性盒,采用酶切連接將其逐一連到溫敏穿梭載體pSET4s。將敲除質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入0

3、5ZYH33感受態(tài)后,通過(guò)同源重組進(jìn)行敲除,利用抗性篩選獲得敲除突變株Asly?！鱯ly與05ZYH33在THB中生長(zhǎng)曲線基本重合;△sly上清中檢測(cè)不到SLY,喪失溶血活性。
　　 2、SLY在致病過(guò)程中的作用
　　 2.1、SLY與豬鏈球菌致病能力相關(guān)
　　 在ICR小鼠的腹腔感染攻毒致死模型中05ZYH33組全部死亡,△sly組無(wú)小鼠死亡,提示sly與豬鏈球菌毒力相關(guān)。腹腔感染小鼠檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血液中菌的含量△s

4、ly與05ZYH33有顯著差異,靜脈感染檢測(cè)小鼠血液中的菌量無(wú)明顯差異,提示sly與穿透腹膜屏障有關(guān),與在血中的存活能力關(guān)系不大。小鼠腹膜的病理切片顯示05ZYH33感染的小鼠腹膜損傷明顯,而感染△sly的損傷卻沒有那么嚴(yán)重,介于對(duì)照組與05ZYH33組之間,進(jìn)一步證明了上述結(jié)論。
　　 2.2、SLY能刺激炎癥因子的釋放且與豬鏈球菌穿過(guò)上皮屏障相關(guān)
　　 與野生株05ZYH33相比,突變株△sly感染ICR小鼠顯著地降

5、低了血清中的炎癥因子水平,SLY刺激炎癥因子釋放可能是增加豬鏈球菌毒力的原因之一。體外實(shí)驗(yàn)顯示膽固醇和TLR4抑制劑(CLI-095)均能顯著地抑制05ZYH33的穿透率,表明SLY有利于通過(guò)TLR4途徑穿透上皮屏障。
　　 3、SLY無(wú)溶血活性點(diǎn)突變蛋白構(gòu)建
　　 通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)重組SLY質(zhì)粒的353氨基酸位進(jìn)行了點(diǎn)突變,獲得了三個(gè)點(diǎn)突變蛋白,SLY(P353A),SLY(P353L),SLY(P353V)。其中S