草魚堿性氨基酸轉運載體y+LAT1和y+LAT2的基因克隆及其mRNA表達研究.pdf

1、魚類腸道中氨基酸的運輸是由其上皮細胞膜上有著不同功能特性的轉運系統(tǒng)完成的，細胞膜上大部分堿性氨基酸的跨膜轉運是由轉運系統(tǒng)b0,+、y+和y+L完成的，這些系統(tǒng)各自包含了不同的氨基酸轉運載體。氨基酸轉運載體常常受到日糧組成、腸道的生理狀態(tài)、發(fā)育階段、激素水平等因素的影響。
　　 魚類經(jīng)常受到饑餓脅迫的原因有環(huán)境條件變化、食物分布不均及個體差異等。有關草魚堿性氨基酸轉運載體基因的表達對饑餓的響應機制的研究有助于了解其適應饑餓脅迫的生

2、態(tài)對策，具有重要的理論意義;該方面的研究對漁業(yè)資源管理、苗種培育、養(yǎng)殖生產(chǎn)以及利用補償生長現(xiàn)象獲得經(jīng)濟效益等方面的實踐也有重要的指導意義。
　　 本文以草魚（Ctenopharyngodon idellus）為研究對象，開展了其兩個堿性氨基酸轉運載體y+LAT1和y+LAT2的克隆，組織表達以及饑餓對其mRNA表達水平的影響等研究工作，為進一步探討魚類腸道中氨基酸吸收轉運的機制奠定了基礎。主要的研究結果如下:
　　 1.

3、y+LAT1和y+LAT2基因cDNA的克隆與分析
　　 y+LAT1基因的cDNA全長序列長2688bp，編碼501個氨基酸，GenBank登錄序列號為JX013494，y+LAT1蛋白含有與其它脊椎動物y+LAT1相似的結構功能區(qū)，包括一個糖基化位點、三個一致的磷酸化蛋白激酶C位點等，它們的氨基酸組成及其位置在不同脊椎動物中高度保守。與其它物種的y+LAT1進行氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，草魚與斑馬魚的同源性最高，達95.0％。構建

4、y+LAT1蛋白系統(tǒng)進化樹與傳統(tǒng)形態(tài)學分類相一致。對y+LAT2基因進行克隆，得到的cDNA序列片段長1849bp，3’末端序列長478bp，編碼456個氨基酸，GenBank登錄序列號為KC206055，y+LAT2蛋白含有與其它脊椎動物y+LAT2相似的結構功能區(qū)，包括一個糖基化位點、三個一致的磷酸化蛋白激酶C位點等，它們的氨基酸組成及其位置在不同脊椎動物中高度保守。與其它物種的y+LAT2進行氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，草魚與斑馬魚的同源

5、性最高，達96.5％。構建y+LAT2蛋白系統(tǒng)進化樹與傳統(tǒng)形態(tài)學分類相一致。
　　 2.y+LAT1和y+LAT2基因的組織表達分析
　　 通過熒光定量PCR技術檢測了兩個堿性氨基酸轉運載體基因在草魚肌肉、腦、鰓、心、腎臟、肝、后腸、中腸、前腸、脾臟中的表達情況。研究結果顯示，草魚堿性氨基酸轉運載體y+LAT1 mRNA在中腸表達量最高(p＜0.05)，前腸和脾臟次之，其它組織表達量從高到低依次為腎臟、后腸、鰓、心臟、肝

6、臟、肌肉和腦;草魚堿性氨基酸轉運載體y+LAT2 mRNA在前腸表達量最高(p＜0.05)，其次是脾臟，而中腸、腎臟、心臟和肌肉的表達量次之，其它組織表達量從高到低依次為肝臟、后腸、鰓和腦。
　　 3.饑餓對草魚y+LAT1和y+LAT2 mRNA表達水平的影響
　　 利用熒光定量PCR技術檢測了饑餓14d后草魚脾臟、腎臟、前腸和中腸中y+LAT1和y+LAT2 mRNA表達量的變化。結果表明，前腸和中腸中y+LAT1基

7、因mRNA的表達量在饑餓1d后其表達量是下降的，隨后在中腸中其表達量是逐漸升高的，但在前腸中其表達量的升高沒有明顯的規(guī)律。脾臟和腎臟中y+LAT1基因mRNA的表達量與前腸和中腸中是不一致的，都是降低的，饑餓的14 d期間腎臟中其表達量是逐漸降低的，脾臟中其表達量是降低的同時保持較低的水平(p＞0.05)。脾臟和腎臟中y+LAT2基因mRNA的表達量分別在饑餓2d和3d達到最低，隨著時間的延長其表達量無規(guī)律性。前腸和中腸中y+LAT2基