草魚(yú)堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體y+LAT1和y+LAT2的基因克隆及其mRNA表達(dá)研究.pdf

1、魚(yú)類腸道中氨基酸的運(yùn)輸是由其上皮細(xì)胞膜上有著不同功能特性的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)完成的，細(xì)胞膜上大部分堿性氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是由轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)b0,+、y+和y+L完成的，這些系統(tǒng)各自包含了不同的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體常常受到日糧組成、腸道的生理狀態(tài)、發(fā)育階段、激素水平等因素的影響。
　　 魚(yú)類經(jīng)常受到饑餓脅迫的原因有環(huán)境條件變化、食物分布不均及個(gè)體差異等。有關(guān)草魚(yú)堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)對(duì)饑餓的響應(yīng)機(jī)制的研究有助于了解其適應(yīng)饑餓脅迫的生

2、態(tài)對(duì)策，具有重要的理論意義;該方面的研究對(duì)漁業(yè)資源管理、苗種培育、養(yǎng)殖生產(chǎn)以及利用補(bǔ)償生長(zhǎng)現(xiàn)象獲得經(jīng)濟(jì)效益等方面的實(shí)踐也有重要的指導(dǎo)意義。
　　 本文以草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）為研究對(duì)象，開(kāi)展了其兩個(gè)堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體y+LAT1和y+LAT2的克隆，組織表達(dá)以及饑餓對(duì)其mRNA表達(dá)水平的影響等研究工作，為進(jìn)一步探討魚(yú)類腸道中氨基酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下:
　　 1.

3、y+LAT1和y+LAT2基因cDNA的克隆與分析
　　 y+LAT1基因的cDNA全長(zhǎng)序列長(zhǎng)2688bp，編碼501個(gè)氨基酸，GenBank登錄序列號(hào)為JX013494，y+LAT1蛋白含有與其它脊椎動(dòng)物y+LAT1相似的結(jié)構(gòu)功能區(qū)，包括一個(gè)糖基化位點(diǎn)、三個(gè)一致的磷酸化蛋白激酶C位點(diǎn)等，它們的氨基酸組成及其位置在不同脊椎動(dòng)物中高度保守。與其它物種的y+LAT1進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，草魚(yú)與斑馬魚(yú)的同源性最高，達(dá)95.0％。構(gòu)建

4、y+LAT1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類相一致。對(duì)y+LAT2基因進(jìn)行克隆，得到的cDNA序列片段長(zhǎng)1849bp，3’末端序列長(zhǎng)478bp，編碼456個(gè)氨基酸，GenBank登錄序列號(hào)為KC206055，y+LAT2蛋白含有與其它脊椎動(dòng)物y+LAT2相似的結(jié)構(gòu)功能區(qū)，包括一個(gè)糖基化位點(diǎn)、三個(gè)一致的磷酸化蛋白激酶C位點(diǎn)等，它們的氨基酸組成及其位置在不同脊椎動(dòng)物中高度保守。與其它物種的y+LAT2進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，草魚(yú)與斑馬魚(yú)的同源

5、性最高，達(dá)96.5％。構(gòu)建y+LAT2蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類相一致。
　　 2.y+LAT1和y+LAT2基因的組織表達(dá)分析
　　 通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了兩個(gè)堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因在草魚(yú)肌肉、腦、鰓、心、腎臟、肝、后腸、中腸、前腸、脾臟中的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示，草魚(yú)堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體y+LAT1 mRNA在中腸表達(dá)量最高(p＜0.05)，前腸和脾臟次之，其它組織表達(dá)量從高到低依次為腎臟、后腸、鰓、心臟、肝

6、臟、肌肉和腦;草魚(yú)堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體y+LAT2 mRNA在前腸表達(dá)量最高(p＜0.05)，其次是脾臟，而中腸、腎臟、心臟和肌肉的表達(dá)量次之，其它組織表達(dá)量從高到低依次為肝臟、后腸、鰓和腦。
　　 3.饑餓對(duì)草魚(yú)y+LAT1和y+LAT2 mRNA表達(dá)水平的影響
　　 利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了饑餓14d后草魚(yú)脾臟、腎臟、前腸和中腸中y+LAT1和y+LAT2 mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，前腸和中腸中y+LAT1基

7、因mRNA的表達(dá)量在饑餓1d后其表達(dá)量是下降的，隨后在中腸中其表達(dá)量是逐漸升高的，但在前腸中其表達(dá)量的升高沒(méi)有明顯的規(guī)律。脾臟和腎臟中y+LAT1基因mRNA的表達(dá)量與前腸和中腸中是不一致的，都是降低的，饑餓的14 d期間腎臟中其表達(dá)量是逐漸降低的，脾臟中其表達(dá)量是降低的同時(shí)保持較低的水平(p＞0.05)。脾臟和腎臟中y+LAT2基因mRNA的表達(dá)量分別在饑餓2d和3d達(dá)到最低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)量無(wú)規(guī)律性。前腸和中腸中y+LAT2基