苦蕎16kD過敏原基因啟動(dòng)子的克隆及功能分析.pdf

1、蕎麥富含蛋白質(zhì)和多種黃酮類物質(zhì)，食用和藥用價(jià)值較高，苦蕎引發(fā)的過敏反應(yīng)日益受到重視?？嗍w16kD過敏原(TBW16)是引起苦蕎過敏癥狀的原因之一。本研究克隆并分析了TB W16啟動(dòng)子序列，將啟動(dòng)子融合β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因用基因槍法轟入苦蕎外植體瞬時(shí)表達(dá)研究其組織特異性。從5'端進(jìn)行啟動(dòng)子截短，將各段啟動(dòng)子缺失片融合熒光素酶轉(zhuǎn)入苦蕎葉片原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)以測定其活性，并根據(jù)各片段上相應(yīng)的激素元件對啟動(dòng)子進(jìn)行脅迫處理，研究其對激素調(diào)

2、控的響應(yīng)規(guī)律。該研究對揭示TBW16啟動(dòng)子的組織特異性和基因在苦蕎中的代謝調(diào)控機(jī)制及其生物學(xué)功能具有重要意義。另外，本研究對TBW16基因的組織特異性進(jìn)行了分析，并構(gòu)建了TB W16基因的干擾和過表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化苦蕎和擬南芥，從分子生物學(xué)途徑開展TBW16基因沉默和過表達(dá)，對進(jìn)一步研究TBW16的功能和消除過敏原、改良苦蕎有重要意義。結(jié)論如下:
　　(1)實(shí)時(shí)定量分析TBW16基因在苦蕎莖、根、葉和種子中的表達(dá)量，結(jié)果表明該基因

3、在苦蕎種子中大量表達(dá)，在苦蕎根、葉、莖中表達(dá)量較低。初步判定該基因的啟動(dòng)子為種子特異性啟動(dòng)子。
　　(2)利用基因組步移法獲得1876bpTBW16啟動(dòng)子序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其具有以下啟動(dòng)子基本元件:轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（-38bp）、TATA-box(-72bp)、CAAT-box(-50);三種激素響應(yīng)元件:2個(gè)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(TGACG-motif,-1584bp;CGTCA-motif,-1407bp)、2個(gè)赤霉素響應(yīng)元

4、件(GARE-motif,-198bp、-1815bp)和1個(gè)脫落酸響應(yīng)元件(ABRE，-156bp);兩個(gè)種子特異性元件(RY-repeat,-92bp、-134bp)。
　　(3)TBW16全長啟動(dòng)子構(gòu)建重組載體TB W16P-pCAPMB IA1301，用基因槍法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入苦蕎外植體根、莖、葉和種子中并啟動(dòng)β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)基因瞬時(shí)表達(dá)，被轟擊的外植體經(jīng)GUS染色后觀察表明，種子中

5、GUS的表達(dá)量最高，葉片中有微量GUS表達(dá)，苦蕎的根和莖中均無肉眼可見的GUS表達(dá)。
　　(4)將全長啟動(dòng)子進(jìn)行5'端缺失形成4段啟動(dòng)子分析片段，并分別構(gòu)建截短啟動(dòng)子的重組雙熒光報(bào)告載體GP-TBW16P1、GP-TB W16P2、GP-TBW16P3和GP-TBW16P4。分別將4種重組載體轉(zhuǎn)入苦蕎葉片原生質(zhì)體中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果顯示在TBW16啟動(dòng)子上存在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的區(qū)域，約位于-1564bp至-1876bp。報(bào)告基因在GA