橙色莫桑比克羅非魚和荷那龍羅非魚Ghrelin和GHSR基因的克隆及組織表達(dá)研究.pdf

1、生長(zhǎng)激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor，GHSR)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，是生長(zhǎng)激素促分泌素(Ghrelin)的一種新發(fā)現(xiàn)的受體。研究表明，Ghrelin與其受體GHSR結(jié)合后，具有促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌，促進(jìn)攝食，調(diào)節(jié)體重，并參與能量平衡的調(diào)節(jié)等生理功能。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)莫桑比克羅非魚和荷那龍羅非魚Ghrelin/GHSR基因結(jié)構(gòu)、功能及其組織分布和饑餓對(duì)Ghrelin和GHSR mR

2、NA表達(dá)量的影響的研究，探討羅非魚生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，為培育快速生長(zhǎng)的羅非魚養(yǎng)殖品種提供理論依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)從荷那龍羅非魚胃總RNA中擴(kuò)增得到Ghrelin cDNA全序列，對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定和分析，結(jié)果表明荷那龍羅非魚Ghrelin cDNA總長(zhǎng)833bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)為324bp，編碼107個(gè)氨基酸的前體蛋白。其中包括22個(gè)氨基酸的成熟肽。成熟肽氨基酸序列GSSFLSPSQKPQNKVKSSRI，成熟

3、肽N-末端第3位氨基酸為絲氨酸，和其他已知脊椎動(dòng)物該基因位點(diǎn)上的氨基酸類別相同。采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)雌、雄荷那龍羅非魚胃、肌肉和垂體等組織中Ghrelin基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，荷那龍羅非魚Ghrelin基因有廣泛的組織分布，Ghrelin基因在雌、雄魚胃中的表達(dá)量均最高，在其它組織的表達(dá)量存在雌雄個(gè)體差異。雌魚肌肉中Ghrelin基因的表達(dá)量明顯高于雄魚，是雄魚的132倍。為了進(jìn)一步研究Ghrelin基因的表達(dá)在荷那龍羅非魚體

4、內(nèi)受能量水平的影響，實(shí)驗(yàn)魚饑餓4周后，采用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)胃中Ghrelin基因表達(dá)量變化，結(jié)果表明：饑餓組較對(duì)照組Ghrelin mRNA表達(dá)量有增加，饑餓組個(gè)體中Ghrelin基因表達(dá)量最高的個(gè)體的表達(dá)量比對(duì)照組中表達(dá)量最低的個(gè)體增加了47.3倍。 采用RT-PCR和RACE技術(shù)從莫桑比克羅非魚和荷那龍羅非魚垂體總RNA中擴(kuò)增得到GHSR cDNA全序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羅非魚GHSR基因存在兩條cDNA鏈，命名為GHS

5、R-1a和GHSR-1b，這一結(jié)果與其他動(dòng)物研究結(jié)論一致。莫桑比克羅非魚mGHSR-1a序列全長(zhǎng)1627bp，編碼385個(gè)氨基酸；mGHSR-1b序列全長(zhǎng)1858bp，編碼299個(gè)氨基酸。荷那龍羅非魚hGHSR-1a序列全長(zhǎng)1630bp，編碼385個(gè)氨基酸；hGttSR-1b序列全長(zhǎng)1861bp，編碼299個(gè)氨基酸。 為進(jìn)一步了解羅非魚GHSR基因表達(dá)的調(diào)控方式，采用RT-PCR和基因組步移技術(shù)獲得了羅非魚GHSR基因的5’側(cè)翼

6、序列。其中莫桑比克羅非魚的長(zhǎng)為1627bp，荷那龍羅非魚的長(zhǎng)為1616bp。序列分析表明：羅非魚GHSR基因5’轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)不含TATA盒，與黑鯛、人的GHSR基因5’側(cè)翼區(qū)域有很多相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，同時(shí)具有自身特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。 利用熒光定量PCR方法檢測(cè)了莫桑比克羅非魚Ghrelin基因及其受體GHSR-1amRNA水平的組織表達(dá)以及饑餓對(duì)其表達(dá)的影響。結(jié)果表明：正常生理?xiàng)l件下，兩基因在所檢測(cè)組織中均有表達(dá)，但存在明顯的組

7、織差異。Ghrelin主要由胃中分泌，除了性腺外，所有被檢測(cè)的組織雌魚體內(nèi)表達(dá)量高于雄魚體內(nèi)表達(dá)量，以肌肉中Ghrelin基因的表達(dá)差異最大，雌魚是雄魚的30.4倍。GHSR-1a在莫桑比克羅非魚垂體、肝臟、心臟中表達(dá)量較高，且被檢測(cè)的組織中雄魚的表達(dá)量均高于雌魚體內(nèi)的表達(dá)量，其中鰓組織的表達(dá)差異最大，雄魚是雌魚的36.3倍。饑餓4周后羅非魚胃中Ghrelin基因表達(dá)增加，雄魚Ghrelin基因分泌量增加較雌魚略高，雄魚增加了3.65倍