羅非魚(yú)GATA-2和P450(11β)基因克隆、表達(dá)及在性腺分化和配子發(fā)生中作用的初步研究.pdf

1、西南大學(xué)碩士學(xué)位論文羅非魚(yú)GATA2和P450（11β）基因克隆、表達(dá)及在性腺分化和配子發(fā)生中作用的初步研究姓名：張未麗申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：水生生物學(xué)指導(dǎo)教師：王德壽200906兩南大學(xué)碩學(xué)位論文研究。發(fā)現(xiàn)羅非魚(yú)GATA2a在腦、垂體、卵巢和鰓表達(dá)，而GH尉2b僅在垂體、卵巢和鰓表達(dá)，且兩者在性腺的表達(dá)都具有明顯的性別二態(tài)性(只在卵巢表達(dá)，而不表達(dá)于精巢)。進(jìn)而，為了研究?jī)蓚€(gè)G■勿2的性別二態(tài)性表達(dá)是否受到外源性激素的影響，實(shí)驗(yàn)了用

2、MT(雄激素甲基睪酮)，F(xiàn)(雌激素合成酶抑制劑)，TAM(雌激素受體拮抗劑)和E2(雌激素)藥物處理羅非魚(yú)導(dǎo)致完全性逆轉(zhuǎn)，并檢測(cè)八個(gè)月大的羅非魚(yú)發(fā)現(xiàn)GATA2a和一2b都表達(dá)于性逆轉(zhuǎn)的雌魚(yú)(XY)，而在的性逆轉(zhuǎn)的雄魚(yú)(XX)中檢測(cè)不到表達(dá)，結(jié)果與對(duì)照組剛好相反。證明GATA2a和拍的表達(dá)與基因型無(wú)關(guān)，只與表型(雌性卵巢)相關(guān)。為了確定羅非魚(yú)兩個(gè)GATA2基因的細(xì)胞表達(dá)類(lèi)型，用原位雜交的方法分別檢測(cè)了兩個(gè)基因在卵巢，腦和垂體中的表達(dá)，結(jié)果

3、顯示GAlA2a和一乃都表達(dá)于卵巢的顆粒細(xì)胞、鞘膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞及腺垂體中細(xì)胞(具體細(xì)胞類(lèi)型未確定)，而GATA2a還表達(dá)于腦的血細(xì)胞及血管附近的細(xì)胞。初步結(jié)果表明它們具有基本相同的組織分布和細(xì)胞表達(dá)類(lèi)型，只是略有差異，暗示其功能也可能不完全一致。在多種硬骨魚(yú)類(lèi)中已有的研究都證明了11酮基睪酮(1lketotestosterone，11KT)是重要的雄激素之一，而P450(1lfl)編碼的11B羥化酶是11KT合成途徑中的關(guān)鍵酶。本研究

4、從尼羅羅非魚(yú)中克隆得到了兩種選擇性剪切形式的P450(1Ifl)，分別命名為P450(1lfl)一，和2，它們的開(kāi)放閱讀框分別長(zhǎng)為1614bp和1227bp，編碼537和408個(gè)氨基酸。P450(1lfl)J基因含有9個(gè)外顯子，而與P450(1lp)J不同的是，P450“l(fā)fl)2缺乏9個(gè)外顯子中的第7和第89b顯子。通過(guò)對(duì)羅非魚(yú)和其他已知的物種的P450(1lfl)序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)羅非魚(yú)P450alfl)一J和青鯔的P450(1lf

5、l)相似性最高。組織分布結(jié)果表明，P450alfl)一l希ne都表達(dá)于雌性和雄性羅非魚(yú)的腎和頭腎，并呈性別二態(tài)性的表達(dá)于性腺(只表達(dá)于精巢，不在卵巢表達(dá))，同時(shí)，在個(gè)檢測(cè)組織r盧P450Hlfl)2的表達(dá)量低于1450(118)一J。通過(guò)對(duì)性腺發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)d450#lp)』和2在孵化后50天的雄性精巢開(kāi)始表達(dá)，卵巢中也沒(méi)有表達(dá)。經(jīng)F、TAM和E2藥物誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)后，P450alfl)J和P450(1lfl)2都強(qiáng)烈表達(dá)于F和TAM

6、處理后性逆轉(zhuǎn)形成的精巢(xx)，而在E2處理誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)產(chǎn)生的卵巢(xY)中它們的表達(dá)被完全抑制，不能被檢測(cè)到。Northernblot分析則進(jìn)一步證明在羅非魚(yú)中存在兩種選擇性剪切形式的p4so(Hp)，并呈現(xiàn)出性別二態(tài)性表達(dá)，僅在精巢中觀察到18和15kb的兩條帶對(duì)應(yīng)于P450(1lfl)J和之兩種剪切形式形成的mRNA，在卵巢和腦中沒(méi)有。原位雜交和免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明劇jDⅣ，歷除強(qiáng)烈表達(dá)于精巢的Leymg細(xì)胞和頭腎腎間細(xì)胞外，還在精

7、原細(xì)胞中有微弱的表達(dá)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明P450(1Ip)在羅非魚(yú)中，除在頭腎中與可的松的合成有關(guān)外，還可能在精巢中通過(guò)11KT的合成對(duì)雄性精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用。本研究從羅非魚(yú)克隆到由兩個(gè)基因編碼的GATA2，兩個(gè)GATA2都只在卵巢表達(dá)，不在精巢表達(dá)；還克隆得到兩種剪切形式的P450(1lfl)，都只在精巢表達(dá)，不在卵巢表達(dá)，而通過(guò)對(duì)性逆轉(zhuǎn)魚(yú)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)都與性腺的表型相關(guān)，與基因型無(wú)關(guān)。并且功能可能分別與性腺分化和