源于胎兒生殖嵴三黃雞胚胎干細胞分離培養(yǎng)及甜菜堿對其增殖和分化影響的研究.pdf

1、本研究的目的是探討源于胎兒生殖嵴三黃雞胚胎干細胞(Embryonic Stem cell，ES細胞)的分離培養(yǎng)及甜菜堿對其增殖和分化的影響。通過研究甜菜堿對三黃雞ES細胞物質(zhì)合成、抗氧化的作用，以及對三黃雞ES細胞體外分化、定向誘導分化為神經(jīng)細胞的影響，揭示甜菜堿調(diào)節(jié)三黃雞ES細胞生長增殖的作用機理，闡明甜菜堿在雞ES細胞分化中的作用。 1、采用酶消化法從5.5天三黃雞胎兒生殖嵴分離獲得雞原始生殖細胞，體外抑制分化培養(yǎng)，來源于原

2、始生殖細胞的ES細胞克隆形成典型的“鳥巢”狀集落。AKP和PAS染色，ES細胞呈陽性。ES細胞具有多分化潛能，能分化形成類胚體，也能分化為上皮細胞、神經(jīng)細胞和心肌細胞。這表明分離培養(yǎng)的雞ES細胞具有典型的胚胎干細胞特性。 2、采用不同濃度的消化液和不同消化時間，從5.5天的三黃雞胎兒生殖嵴分離獲得原始生殖細胞，用含不同濃度犢牛血清的抑制分化培養(yǎng)液培養(yǎng)來源于雞原始生殖細胞的ES細胞，測定ES集落數(shù)，探討消化液濃度、消化時間、犢牛血

3、清對雞ES細胞分離培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，采用0.1％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化液從雞生殖嵴分離原始生殖細胞的效果最好，消化時間是4 min。在抑制分化培養(yǎng)液中添加20％NBS培養(yǎng)雞ES細胞的效果最好，繼代消化時間是40 s。 3、在抑制分化培養(yǎng)液中分別添加5、10、15、20 mmol/L甜菜堿，培養(yǎng)雞ES細胞，對照組雞ES細胞僅用抑制分化培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察雞ES細胞的形態(tài)和生長行為，測定雞ES細胞集落數(shù)、傳代數(shù)，以及蛋白質(zhì)

4、、DNA和RNA含量，并對添加不同濃度甜菜堿對雞ES細胞是否存在毒性作用進行評價。結(jié)果表明，①添加5、10、15 mmol/L甜菜堿可提高雞ES細胞克隆數(shù)和傳代數(shù)，以添加15 mmol/L甜菜堿效果最好，傳代數(shù)可達10代。添加20 mmol/L甜菜堿組的雞ES細胞從1代和2代開始克隆的集落數(shù)急劇下降，僅傳至第五代。②與對照組相比，各添加甜菜堿組均可極顯著(P<0.01)提高雞ES細胞蛋白質(zhì)含量，以添加15 mmol/L甜菜堿效果最好。添

5、加10、15 mmol/L甜菜堿組可極顯著(P<0.01)提高雞ES細胞DNA含量，添加20 mmol/L甜菜堿則降低雞ES細胞DNA含量，但差異不顯著(P>0.05)。③與對照組相比，添加5、10、15mmol/L甜菜堿能提高雞ES細胞增殖率，對雞ES細胞無毒害作用。而添加20mmol/L甜菜堿雞ES細胞增殖率降低，對雞ES細胞有毒害作用。 4、外源性氧化劑H2O2制備雞ES細胞氧化損傷模型，探討甜菜堿對雞ES細胞抗氧化作用的

6、影響。結(jié)果表明，添加10、15 mmol/L，甜菜堿極顯著(P<0.01)提高氧化狀態(tài)下雞ES細胞SOD和GSH-Px酶活性，15 mmol/L甜菜堿還顯著減少MDA的產(chǎn)生(P<0.05)。添加20 mmol/L甜菜堿極顯著(P<0.01)提高氧化狀態(tài)下雞ES細胞SOD和GSH-Px酶活性，但比添加15 mmol/L甜菜堿的抗氧化作用弱。 5、在培養(yǎng)液中添加不同含量甜菜堿，探討甜菜堿對雞ES細胞體外分化的影響。結(jié)果表明，甜菜堿對

7、雞ES細胞無定向誘導分化作用，且抑制雞ES細胞向心肌細胞分化。 6、維甲酸(retinoic acid，RA)聯(lián)合甜菜堿體外定向誘導雞ES細胞分化為神經(jīng)細胞，對照組僅添加RA，測定神經(jīng)細胞分化率，探討甜菜堿對由RA定向誘導雞ES細胞分化為神經(jīng)細胞的影響。結(jié)果表明，聯(lián)合添加RA和甜菜堿或僅添加RA均誘導74％～85％雞ES細胞分化為神經(jīng)細胞，分化形成的神經(jīng)細胞呈網(wǎng)狀連接，大部分為雙極細胞，有小部分分化細胞胞體成多邊形，有多個短突起

8、，類似多級神經(jīng)元。添加10、15 mmol/L甜菜堿能顯著(P<0.05)提高神經(jīng)細胞分化率，促進RA定向誘導雞ES細胞分化為神經(jīng)細胞，且以添加10 mmol/L甜菜堿效果最好。 綜上，從雞胚胎生殖嵴分離培養(yǎng)的雞ES細胞具有典型的胚胎干細胞特性。甜菜堿可以促進雞ES細胞的生長增殖，同時發(fā)揮著抗氧化作用，但高劑量(20mmol/L甜菜堿)對雞ES細胞有毒害作用，抑制三黃雞ES細胞增殖。雞ES細胞分化研究表明，甜菜堿對雞ES細胞無定