家兔類胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)及羊棲菜多糖對(duì)其生長(zhǎng)增殖和分化的影響.pdf

1、本試驗(yàn)的旨在分離培養(yǎng)獲得家兔類胚胎干細(xì)胞及研究羊棲菜多糖對(duì)家兔類ES細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和分化的影響，從細(xì)胞水平探討SFPS的營(yíng)養(yǎng)作用和藥理功能。通過(guò)研究SFPS對(duì)家兔類ES細(xì)胞飼養(yǎng)層生長(zhǎng)增殖和細(xì)胞因子分泌的影響及其對(duì)家兔類ES細(xì)胞物質(zhì)合成、抗氧化和分化的作用，揭示SFPS調(diào)節(jié)家兔類胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用機(jī)理，闡明SFPS對(duì)家兔類ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的作用。 1.從13-15dpc家兔胎兒生殖嵴分離出原始生殖細(xì)胞培養(yǎng)于小鼠胎兒成纖

2、維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層和家兔胎兒成纖維細(xì)胞(REF)飼養(yǎng)層，以胰蛋白酶消化法和機(jī)械分離-胰蛋白酶消化法進(jìn)行傳代，并對(duì)培養(yǎng)得到的家兔類ES細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：以MEF作為飼養(yǎng)層，用機(jī)械分離.胰蛋白酶消化法傳代，更有利于家兔類ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)，最高傳至6代，培養(yǎng)得到的家兔類胚胎干細(xì)胞AKP染色和PAS染色陽(yáng)性，保持完整的染色體組(2n=44)，具有多分化潛能，可形成類胚體，可分化為上皮樣細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞。

3、2.用含5、10、20、40、80mg/LSFPS的培養(yǎng)液培養(yǎng)家兔類ES細(xì)胞飼養(yǎng)層(即MEF)，研究SFPS對(duì)MEF生長(zhǎng)增殖、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收利用和細(xì)胞因子分泌的影響。結(jié)果表明：5、10、20mg/LSFPS對(duì)MEF形態(tài)和生長(zhǎng)增殖無(wú)顯著影響(P>0.05)，40、80mg/LSFPS對(duì)MEF表現(xiàn)出明顯的抑制作用(P<0.05)，使MEF突觸分叉，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多；SFPS可顯著促進(jìn)MEF對(duì)葡萄糖的攝取利用(P<0.05)，但對(duì)鈣和氨基酸的利用

4、無(wú)顯著影響(P>0.05)；低濃度SFPS有促進(jìn)MEF堿性成纖維細(xì)胞因子(bFGF)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)分泌的趨勢(shì)，但高濃度SFPS有減少M(fèi)EF分泌bFGF、SCF和LIF的的趨勢(shì)。 3.用不同濃度SFPS培養(yǎng)家兔類ES細(xì)胞，觀察家兔類ES細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)行為，測(cè)定其集落數(shù)和傳代數(shù)，以及家兔類ES細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、RNA的含量。結(jié)果表明：5、10、20mg/L SFPS對(duì)家兔類ES細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖

5、有促進(jìn)作用，集落數(shù)量多，體積大，最高傳至7代，40、80mg/LSFPS對(duì)家兔類ES細(xì)胞發(fā)生毒性作用，集落數(shù)量減少，易分化，傳3-4代后丟失。SFPS對(duì)家兔類ES細(xì)胞蛋白質(zhì)的含量無(wú)顯著影響(P>0.05)，5、10、20mg/L SFPS可顯著提高家兔類ES細(xì)胞DNA、RNA含量(P<0.01)，40、80mg/LSFPS對(duì)家兔類ES細(xì)胞DNA含量無(wú)顯著影響(P>0.05)，但顯著降低RNA的含量(P<0.01)。 4.以H2O

6、2為家兔類ES細(xì)胞外源性氧化劑，制備氧化損傷模型，并用不同濃度SFPS對(duì)家兔類ES細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)和修復(fù)，探討SFPS對(duì)家兔類ES細(xì)胞的抗氧化作用。結(jié)果顯示：5、10、20mg/LSFPS對(duì)家兔類ES細(xì)胞具有保護(hù)和修復(fù)作用，可顯著提高氧化損傷家兔類ES細(xì)胞的增殖活力以及SOD和GSH-Px酶活性，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，抑制H2O2導(dǎo)致的DNA斷鏈。40、80 mg/LSFPS對(duì)氧化損傷家兔類ES細(xì)胞的保護(hù)和修復(fù)作用不明顯，有時(shí)反而加劇對(duì)家兔類E

7、S細(xì)胞的損傷，對(duì)DNA斷鏈的抑制作用較弱。 5.以家兔胎肝提取液為肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑，同時(shí)與SFPS聯(lián)合使用誘導(dǎo)家兔類胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，探討SFPS對(duì)家兔類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示：胎肝提取液可誘導(dǎo)家兔類胚胎干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞，誘導(dǎo)分化細(xì)胞呈圓形、星形、不規(guī)則多邊形，具有糖原貯存、ICG攝取和排泄功能，能夠合成白蛋白和尿素。并且家兔類胚胎干細(xì)胞在體外也能自發(fā)分化為肝細(xì)胞，但分化率較低。低濃度SFPS對(duì)胎肝提

8、取液誘導(dǎo)家兔類胚胎干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞有一定促進(jìn)作用，可提高分化細(xì)胞PAS染色和ICG攝取陽(yáng)性率，促進(jìn)誘導(dǎo)分化形成的肝細(xì)胞白蛋白和尿素的合成。 綜上所述，從胎兒生殖嵴分離培養(yǎng)的家兔類胚胎干細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞的特征。并且，低濃度SFPS促進(jìn)家兔類ES細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，高濃度SFPS起抑制作用，SFPS促進(jìn)飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，同時(shí)發(fā)揮抗氧化作用可能是其促進(jìn)家兔類ES細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用機(jī)理。低濃度SFPS對(duì)胎肝提取液誘導(dǎo)家兔類胚胎干細(xì)