外源重組Wnt3a蛋白對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞數(shù)量及分泌活性影響的研究.pdf

1、奶牛的乳腺組織具有合成及分泌乳汁的特殊功能，而這一功能是由乳腺上皮細胞來完成的，上皮細胞的數(shù)量及其分泌活性直接影響到奶牛的產(chǎn)奶量。奶牛的乳腺組織具有重塑的功能，伴隨著泌乳周期周而復始的變化，不斷的進行退化和重塑。如果在乳腺組織重塑的過程中，能夠使具有泌乳功能的上皮細胞的數(shù)量在有限的空間內(nèi)增加更多，活性更強，那么對乳產(chǎn)量具有重要的意義。有研究證明成年小鼠乳腺中含有對Wnt蛋白敏感的細胞群，這一細胞群中含有豐富的乳腺干細胞，并證實了Wnt3

2、a蛋白對乳腺干細胞集落的形成有明顯的促進作用，維持了其形成功能性腺體的功能。推測，Wnt通路的激活可以促進奶牛乳腺上皮細胞的增殖。
　　本實驗以健康奶牛乳腺組織為原材料，組織塊培養(yǎng)方法進行細胞培養(yǎng)，用倒置顯微鏡對培養(yǎng)的細胞進行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組織塊培養(yǎng)至3-4天有成纖維細胞長出，6天左右有鵝卵石樣和鋪路石樣上皮細胞長出，細胞核大而明顯，有2至4個核仁，細胞間隔緊密。
　　細胞培養(yǎng)液中β-酪蛋白提取方法的改進。因所培養(yǎng)的細胞為

3、原代單層貼壁細胞，細胞數(shù)量有限，故培養(yǎng)液中上皮細胞分泌物的量很少，不易檢測。本實驗中采用了四種蛋白提取方法對細胞培養(yǎng)液中的β-酪蛋白進行提取，并結(jié)合western-blot方法對提取液進行鑒定，獲得了操作簡單，經(jīng)濟實用，切實可行的提取方法，即物理沉淀法。同時證明了所獲得的乳腺上皮細胞具有正常分泌功能。從而，初步建立了奶牛乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)體系。
　　在組織塊培養(yǎng)48h進行第一次換液時，細胞培養(yǎng)液中添加不同濃度(10ng/mL、

4、25ng/mL和50ng/mL)的外源性重組Wnt3a蛋白。選取各組培養(yǎng)至7-11天的細胞（各兩個重復），用酶消化法純化細胞，所得細胞進行計數(shù)，繪制細胞生長曲線。收集10-12天的細胞培養(yǎng)液，用Western-blot方法檢測培養(yǎng)至10-12天的細胞培養(yǎng)液中β-酪蛋白的分泌量。與此同時，待收集細胞培養(yǎng)液后，用酶消化法消化三次去除成纖維細胞，得到純化的上皮細胞，提取上皮細胞中總RNA，采用熒光定量PCR方法對Wnt/β-catenin信號

5、通路中Frizzled1受體和β-catenin的mRNA表達進行了測定。三組中Frizzled1受體mRNA相對表達量分別為0.79、1.13和1.89，β-catenin的mRNA相對表達量分別為0.44、0.91和1.19。
　　結(jié)論:初步建立了奶牛乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)體系，成功摸索出β-酪蛋白的提取方法;50ng/mL的Wnt3a為本實驗中刺激乳腺上皮細胞的最適宜濃度，上皮細胞的數(shù)量和β-酪蛋白的分泌量明顯較高于其他各組