中華絨螯蟹短尾化發(fā)育相關(guān)基因的克隆與界定.pdf

1、中華絨螯蟹（Eriocheir japonica sinensis）屬節(jié)肢動物門（Arthropoda）甲殼亞門（Crustacea）
　　 十足目（Decapoda）爬亞目（Reptantia）短尾部（Brachyura）方蟹科（Grapsidae）絨螯蟹屬，俗稱河蟹、大閘蟹、毛蟹等，是我國重要的經(jīng)濟水產(chǎn)物種。在其幼體的發(fā)育過程中有一個短尾化（brachyurization）的變態(tài)過程，特別是在大眼幼體期至仔蟹Ⅰ期之間外部形態(tài)

2、發(fā)生顯著改變，例如頭胸部變寬，整個腹部形狀變扁并反轉(zhuǎn)貼于頭胸部下，腹肢退化、失去游泳功能，雄性個體甚至失去兩對腹肢等等。短尾化是短尾類動物具有的保守和普遍性發(fā)育模式。至今，關(guān)于短尾類動物短尾化變態(tài)的研究多集中在形態(tài)、生理和生態(tài)等方面，對短尾化變態(tài)發(fā)育調(diào)控基因方面的研究，國內(nèi)外尚未見報道。
　　 本研究中采用正向和反向抑制性消減雜交（suppression subtractive hybridization，SSH）
　　

3、 技術(shù)分離中華絨螯蟹幼體發(fā)育過程中的短尾化變態(tài)發(fā)育特異表達基因，并用cDNA末端快速擴增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）的方法克隆短尾化相關(guān)基因的全長cDNA序列。然后用半定量和定量RT-PCR對一些基因在短尾化發(fā)育過程中的表達差異性進行研究。
　　 第一章中華絨螯蟹腹部組織抑制性消減cDNA文庫的構(gòu)建及表達序列標簽分析應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建了中華絨螯蟹腹部兩個發(fā)育時期（大眼幼體

4、期和仔蟹Ⅰ
　　 期）的雙向消減cDNA文庫（SSH文庫1和SSH文庫2）。其中以Ⅰ期仔蟹腹部為試驗方（Tester），大眼幼體腹部為驅(qū)動方（Driver）進行正向消減雜交；以大眼幼體腹部為試驗方，I期仔蟹腹部為驅(qū)動方進行反向消減雜交。分別提取大眼幼體和I期仔蟹腹部組織的總RNA、mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，置換法合成第二鏈，然后經(jīng)Rsa I酶切、接頭連接、兩輪消減雜交和兩輪PCR，獲得正、反向消減雜交產(chǎn)物。消減雜交產(chǎn)物

5、經(jīng)純化后克隆入質(zhì)粒表達載體（pGEM-T easy Vector），轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。最后所獲正向消減文庫含374個重組子，反向消減文庫含985個重組子。PCR擴增鑒定正、反向消減cDNA文庫的插入片段平均大小分別約為440 bp和380 bp，表明所構(gòu)建的消減cDNA文庫適合進一步研究中華絨螯蟹短尾化發(fā)育相關(guān)基因。結(jié)果初步提示中華絨螯蟹的短尾化發(fā)育可能涉及多基因或基因群。進一步分析獲得的表達序列標簽序列，結(jié)果表明SSH文庫1和S

6、SH文庫2中分別有211個和669個非冗余表達序列標簽序列；對其的聚類分析表明SSH文庫1包括130個獨立轉(zhuǎn)錄本（25個多拷貝基因和105個單拷貝基因），而SSH文庫2包括195個獨立轉(zhuǎn)錄本（51個多拷貝基因和144個單拷貝基因）。
　　 功能分析顯示這些基因可能參與各種細胞加工、核糖體蛋白質(zhì)合成、蛻皮、信號轉(zhuǎn)導、發(fā)育、能量代謝、免疫與壓力調(diào)控等。
　　 第二章中華絨螯蟹腹部組織RACE cDNA文庫的構(gòu)建運用SMART

7、技術(shù)，構(gòu)建了中華絨鰲蟹腹部組織（仔蟹I期和大眼幼體期）SMART RACEcDNA文庫。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，文庫所含全長cDNA的長度主要集中在750一2000bp之間。RACE PCR結(jié)果表明，所用基因特異性引物與接頭引物皆能擴增出產(chǎn)物，說明所構(gòu)文庫的質(zhì)量較好，適于用RACE方法從中分離中華絨鰲蟹短尾化發(fā)育相關(guān)基因的全長cDNA。
　　 第三章中華絨螯蟹熱激蛋白90基因全長cDNA克隆、mRNA表達定量分析和序列分析熱激蛋

8、白家族中分子量為90kDa的熱激蛋白90（HSP90）是真核細胞胞質(zhì)中最豐富和高度保守的蛋白質(zhì)之一。根據(jù)EST分析結(jié)果，分別用5' RACE和3' RACE技術(shù)從中華絨螯蟹基因組中獲得了一個熱激蛋白90基因（命名為EjsHSP90）的全長cDNA序列。EjsHSP90cDNA全長為2,517bp并包含一個2,157bp的開放閱讀框，編碼一個82.85kDa的氨基酸多肽。該蛋白質(zhì)具有熱激蛋白90家族的顯著特征并有一個ATPase結(jié)合域；序

9、列比對顯示EjsHSP90與其他動物的HSP90分享79—96％的序列相似度并具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)特征。用RT-PCR方法對該基因的表達譜進行了研究，同時用熒光定量PCR方法對該基因在三個不同發(fā)育時期的三種類型組織樣品中的表達差異性進行了進一步分析。結(jié)果表明該基因在三個發(fā)育時期的不同組織中均有表達且表達水平變化明顯（P＜0.05），其在仔蟹I期的腹部表達量最高且明顯高于在其他組織部位的表達量，而且熒光定量PCR結(jié)果排除了EjsHSP90m

10、RNA在仔蟹I期腹部的高表達主要由滲透性應(yīng)激誘導的可能性。另外，以熱激基因進行的相關(guān)系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明其能為節(jié)肢動物系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系重建提供有益信息和補充證據(jù)。
　　 第四章中華絨螯蟹錨蛋白基因全長cDNA克隆、mRNA表達定量分析和序列分析錨蛋白（Ankyrins）家族是一類在膜蛋白和細胞支架蛋白等之間起橋梁作用的銜接分子。
　　 根據(jù)EST分析結(jié)果，分別用5'RACE和3'RACE技術(shù)從中華絨螯蟹基因組中獲得了一個錨蛋

11、白基因（命名為EjsANK）的全長cDNA序列。EjsANK cDNA全長為4,375bp并包含一個1,095bp的開放閱讀框，編碼一個40.23kDa的含364個氨基酸的多肽。EjsANK cDNA具一個獨特的長為3,073 bp的3'-非翻譯區(qū)，包含三個K-box功能域、一個GY-like box功能域和一個Brd-like box功能域。序列比對和三維結(jié)構(gòu)分析表明EjsANK蛋白是錨蛋白家族一個新的胞質(zhì)蛋白成員。
　　 用

12、RT-PCR方法對該基因的表達譜進行了研究，同時用熒光定量PCR方法對該基因在三個不同發(fā)育時期的三種類型組織樣品中的表達差異性進行了進一步分析。結(jié)果表明該基因在三個發(fā)育時期的不同組織中均有表達但腹部組織表達水平變化最明顯（P＜0.05），其在仔蟹I期的腹部表達量最高且明顯高于在其他組織部位的表達量。對該基因的功能進行生物信息學預測分析表明其和IκB蛋白具有高度類似的功能，IκB蛋白是哺乳動物細胞中IκB/NF-κB復合物的關(guān)鍵組成因子，

13、該復合物已被證實在多種生物發(fā)育過程中起重要作用。本實驗的結(jié)果表明EjsANK基因很可能參與中華絨螯蟹的早期發(fā)育調(diào)控，特別是幼體的短尾化發(fā)育調(diào)控。
　　 第五章中華絨螯蟹增殖細胞核抗原基因全長cDNA克隆、mRNA表達定量分析和序列分析增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）與細胞DNA合成關(guān)系密切，在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標。根據(jù)EST 分析

14、結(jié)果，分別用5'RACE和3'RACE技術(shù)從中華絨螯蟹基因組中獲得了一個增殖細胞核抗原基因（命名為EjsPCNA）的全長cDNA序列。EjsPCNA cDNA全長為1,123bp并包含一個780bp的開放閱讀框，編碼一個28.62kDa的含259個氨基酸的多肽；編碼的氨基酸序列包含保守的結(jié)構(gòu)域間連接loop、核心loop和C-端尾。通過序列比對、系統(tǒng)發(fā)生分析、序列結(jié)構(gòu)比較和一些生物信息學預測分析，表明EjsPCNA蛋白是PCNA家族成員

15、。用RT-PCR方法對該基因的表達譜進行了研究，同時用熒光實時定量PCR方法對該基因在三個不同發(fā)育時期的兩種類型組織樣品中的表達差異性進行了進一步分析。結(jié)果表明該基因在三個發(fā)育時期的不同組織中均有表達，但在頭胸部組織的表達水平變化明顯（P＜0.05），在仔蟹I 期的頭胸部表達量最高且明顯高于在其它時期頭胸部和腹部組織的表達量。本實驗的結(jié)果表明中華絨螯蟹的EjsPCNA基因表達水平的變化與其發(fā)育階段形態(tài)變化和身體的細胞增殖活動具有緊密聯(lián)系

16、，提示EjsPCNA基因參與中華絨螯蟹的早期發(fā)育，該基因也可作為細胞增值的標記。
　　 第六章中華絨螯蟹翻譯起始因子4G基因全長cDNA克隆和序列分析翻譯起始因子4G（eIF4G）作為骨架蛋白對eIF3起募集反應(yīng)，并充當eIF4E和eIF4A之間的分子橋梁；它位于復合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心，在蛋白表達過程中起決定作用。本實驗根據(jù)EST 分析結(jié)果，分別用5'RACE和3'RACE技術(shù)從中華絨螯蟹基因組中獲得了一個真核生物翻譯起始因子基因（

17、命名為EjseIF4G）的全長cDNA序列，EjseIF4G cDNA全長為3,055bp并包含兩個開放閱讀框，ORF1有963個堿基，ORF2有798個堿基，它們編碼一個78.62kDa的含693個氨基酸的多肽EjseIF4G，編碼的氨基酸序列包含保守的MIF4G結(jié)構(gòu)域、MA3結(jié)構(gòu)域和W2/eIF5C 結(jié)構(gòu)域。通過序列同源性比對、序列結(jié)構(gòu)比較和一些生物信息學預測分析，結(jié)果表明EjseIF4G蛋白是eIF4G家族成員，它為非分泌蛋白，不