基于中華絨螯蟹EST序列的深度發(fā)掘-免疫和營養(yǎng)相關基因的克隆與表達研究.pdf

1、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟養(yǎng)殖品種，目前以形成了龐大的產(chǎn)業(yè)，創(chuàng)造了可觀的經(jīng)濟利潤和社會效益。但隨著中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，各種疾病頻發(fā)，嚴重制約了產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。由于中華絨螯蟹在內(nèi)的甲殼動物不具備適應性免疫而僅具有先天免疫，所以探明先天免疫相關基因的作用機制對于闡明甲殼動物的先天免疫應答步驟和機理，解決生產(chǎn)中碰到的疾病問題有深遠的意義。除了病害，飼料也是制約中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。由于

2、目前國際魚粉價格的居高不下，飼料成本逐漸增加，提高中華絨螯蟹對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率可為緩解當前飼料成本居高的想象提供有效手段，而隨著飼料營養(yǎng)物質(zhì)利用效率的提高，養(yǎng)殖業(yè)對水體環(huán)境的污染也降低，這又在另一方面促進了產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。鑒于以上原因，本論文克隆得到了中華絨螯蟹組織蛋白酶L(catL)，組織蛋白酶C(catC)，組織蛋白酶A(catA)，巨噬細胞游走抑制因子(MIF)和脂肪酸結合蛋白(FABP)基因，分析了其在中華絨螯蟹不同組織

3、中的表達情況，并研究了病原微生物感染后免疫相關基因的表達模式，精巢快速發(fā)育期營養(yǎng)相關基因的的表達模式和微量元素鋅對其影響。
　　 1.組織蛋白酶L的基因克隆及其表達分析
　　 組織蛋白酶家族是廣泛存在與機體各組織中的一類基因，他們在機體的免疫能力、對營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用等方面都發(fā)揮了重要作用。中華絨螯蟹catL的cDNA全長1274 bp，其中包括編碼325個氨基酸殘基的長為978 bp的開放閱讀框。與其他物種catL的氨

4、基酸比對分析發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹具有該家族基因所共有的基序?；虻臅r空表達分析表明，catL基因在各組織中廣泛表達，其中在肝胰腺、鰓、胃和血細胞中的表達量最高。當中華絨螯蟹經(jīng)鰻弧菌感染后發(fā)現(xiàn)，catL基因的mRNA表達量與酶活都在攻毒后8小時達到最高。上述研究證實catL參與了中華絨螯蟹的先天免疫應答。
　　 2.組織蛋白酶C的基因克隆及其表達分析
　　 中華絨螯蟹catC的cDNA全長1481 bp，其中包括編碼427個氨基

5、酸殘基的長為1284 bp的開放閱讀框。與其他物種catC的氨基酸比對分析發(fā)現(xiàn)中華絨螯
　　 蟹catC的蛋白質(zhì)序列與其他物種有較高的相似度。當中華絨螯蟹經(jīng)鰻弧菌感染后發(fā)現(xiàn)，catC基因的mRNA表達量在攻毒后6小時達到最高。上述研究證實catC參與了中華絨螯蟹的先天免疫應答。
　　 3.組織蛋白酶A的基因克隆及其表達分析
　　 中華絨螯蟹catA的cDNA全長2200 bp，其中包括編碼465個氨基酸殘基的長為

6、1398 bp的開放閱讀框。與其他物種catA的氨基酸比對分析發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹catA的蛋白質(zhì)序列與其他脊椎動物的相似度為48％到51％。CatA的時空表達分析表明該基因具有組織依賴性，并且在鰓中的表達量最高。當中華絨螯蟹經(jīng)鰻弧菌感染后發(fā)現(xiàn)，catA基因的mRNA表達量在攻毒后12小時達到最高。上述研究證實catA參與了中華絨螯蟹的先天免疫應答。
　　 4.巨噬細胞游走抑制因子的基因克隆及其表達分析
　　 MIF作為一種多

7、功能的細胞因子在先天免疫和后天免疫的應答過程中都有重要作用，但其在甲殼動物先天免疫中的作用機制仍不明。因此我們克隆得到了了中華絨螯蟹的MIF基因，并對其組織表達和免疫功能進行了分析。結果表明，中華絨螯蟹MIF的cDNA全長704 bp，其中包括編碼120個氨基酸殘基的長為363bp的開放閱讀框。與其他物種catA的氨基酸比對分析發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹具有該基因所共有的活化位點。MIF的時空表達分析表明該基因具有組織特異性，并且在肝胰腺中的表達量

8、最高。當中華絨螯蟹經(jīng)鰻弧菌感染后發(fā)現(xiàn)，catA基因在血淋巴中的mRNA表達量在攻毒后8小時達到最高，在肝胰腺和鰓中的表達量均在攻毒后12小時達到最高。上述研究證實MIF參與了中華絨螯蟹的先天免疫應答。
　　 5.脂肪酸結合蛋白基因克隆及其在精巢快速發(fā)育期不同組織的表達分析
　　 FABP是一類對于機體脂肪酸運輸和代謝有重要作用的蛋白，其功能在脊椎動物中已被廣泛研究，但在無脊椎動物，特別是甲殼動物中的研究極少。因此我們克隆

9、得到了了中華絨螯蟹的FABP基因，并對其組織表達和在精巢快速發(fā)育期不同組織的表達變化進行了分析。結果表明，中華絨螯蟹FABP的cDNA全長898bp，其中包括編碼136個氨基酸殘基的長為411bp的開放閱讀框。與其他物種FABP的氨基酸比對分析發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹具有該基因所共有的簽名序列。FABP的時空表達分析表明該基因在中華絨螯蟹各組織中廣泛表達，并且在腸、卵巢、精巢和心臟中的表達量最高。對處于精巢快速發(fā)育期的中華絨螯蟹的FABP基因表達

10、量的分析表明，各組織中FABP的表達量都依賴于精巢的發(fā)育階段。研究證明了FABP在中華絨螯蟹精巢快速發(fā)育階段脂肪酸運輸和代謝過程中的重要作用，并間接證明了肝胰腺、精巢、卵巢和血細胞在脂肪酸運輸過程中的相互作用。
　　 6.飼料鋅對中華絨螯蟹生長、肝胰腺脂肪酸組成和相關基因表達的影響
　　 鋅是一類具有多功能的微量元素，與機體內(nèi)很多含鋅酶和依賴鋅的酶有重要的相互作用，是中華絨螯蟹的必需營養(yǎng)元素，對于中華絨螯蟹的免疫能力和營

11、養(yǎng)物質(zhì)代謝能力有重要的作用。為了全面衡量飼料鋅濃度對中華絨螯蟹生長、免疫能力和營養(yǎng)物質(zhì)代謝能力的影響，本實驗設計了5個濃度梯度的含鋅飼料(0，10，20，40 and80 mg/kg飼料)對中華絨螯蟹飼養(yǎng)8周后測定了相關指標。結果表明，當飼料鋅添加量為20mg Zn/kg飼料，飼料鋅實測濃度為27 mg Zn/kg飼料時中華絨螯蟹有最大體增重率。肝胰腺的鋅濃度隨著飼料鋅添加量的增加而提高。肝胰腺的脂肪酸組成隨著飼料鋅濃度的提高而變化。隨