中華絨螯蟹PDGF-VEGDF和Astakine基因的克隆表達及功能研究.pdf

1、中華絨螯蟹是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟動物，但近年來疾病的頻繁發(fā)生給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，目前病害問題已經(jīng)成為嚴重制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要障礙。從中華絨螯蟹機體本身入手，研究其免疫防御機制，從而制定合理的“綠色、環(huán)保”的養(yǎng)殖策略，對水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展及人類健康都具有重要意義。細胞因子作為免疫活性細胞間相互作用的介質(zhì)，對免疫應(yīng)答的發(fā)生、調(diào)節(jié)及效應(yīng)等均起重要作用。他們參與許多細胞過程，如細胞增殖，分化，細胞膜表面的受體激活及細胞因子有關(guān)

2、的基因調(diào)控。
　　 本研究采用大規(guī)模EST測序方法，結(jié)合cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)從中華絨螯蟹中克隆到了PDGF/VEGF和Astakine基因的cDNA全長序列：采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了這兩個基因在健康個體中的組織分布以及鰻弧菌和酵母菌刺激后血淋巴細胞中的時序表達規(guī)律；同時，將PDGF/VEGF的編碼區(qū)克隆到pET30(a+)載體中，在大腸桿菌

3、中實現(xiàn)了重組表達，并進行了體外活性檢測。
　　 本研究從中華絨螯蟹中克隆了PDGF/VEGF（命名為EsPDGF/VEGF），其cDNA全長為1773bp，5’非翻譯區(qū)為54bp，開放閱讀框為588bp，編碼一條由196個氨基酸殘基組成的多聚肽，其理論分子量為20.2kDa，等電點為7.46，3’非翻譯區(qū)為1131bp。經(jīng)SignalP和SMART預(yù)測有一個信號肽及典型的PDGF結(jié)構(gòu)域。推導(dǎo)的EsPDGF/VEGF氨基酸序列與其

4、他已知的PDGF/VEGF氨基酸序列具有一定的同源性。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測組織分布顯示，EsPDGF/VEGF在血淋巴、肝胰腺和肌肉組織中的表達量較高，在性腺、腮和心臟組織中的表達量較低。在中華絨螯蟹受到鰻弧菌刺激后，EsPDGF/VEGF的表達量在24hr時與空白組相比具有極顯著性差異：受到酵母菌刺激后，EsPDGF/VEGF基因的表達量與空白組相比在3hr時具有極顯著性差異，在12、24和48hr時具有顯著性差異，表明該基

5、因參與中華絨螯蟹對入侵病原菌的防御反應(yīng)。當(dāng)中華絨螯蟹受到損傷刺激時，EsPDGF/VEGF的表達量在8hr時達到了空白組的2269倍，說明EsPDGF/VEGF參與了中華絨螯蟹機體損傷的組織修復(fù)。將EsPDGF/VEGF的編碼區(qū)片段重組到nET-30(a+）載體上，在BL21(DE3)中表達重組蛋白，該重組蛋白對生物胺（多巴胺、腎上腺素和去甲腎上腺素）的釋放有促進作用。
　　 本文克隆了中華絨螯蟹Astakine基因(命名為Es

6、Astakine)cDNA序列。cDNA全長1163bp，5’非翻譯區(qū)為120bp，開放閱讀框為387bp，編碼128個氨基酸，其理論分子量為31.8，等電點為5.18，3’非翻譯區(qū)為656bp。經(jīng)SignalP預(yù)測沒有信號肽，但是經(jīng)SMART程序預(yù)測EsAstakine有一個prokineticin結(jié)構(gòu)域。推導(dǎo)的EsAstakine氨基酸序列與其他已知的Astakines氨基酸序列具有一定的同源性。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測組織分