PCV2-ORF2基因的表達、純化及小鼠免疫效力研究.pdf

1、豬II型圓環(huán)病毒(PCV2)是近年來發(fā)現(xiàn)的動物病毒之一，該病毒與豬的多種疾病綜合癥有關(guān)，特別是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥。該病最早于1991年在加拿大西部發(fā)現(xiàn)，病原學(xué)及血清學(xué)調(diào)查表明在許多國家都廣泛存在，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。研究表明在主要的幾個開放閱讀框中，ORF1相對保守，主要編碼病毒的復(fù)制蛋白，而ORF2相對變異較大，是主要的免疫原性基因，也是PCV2亞單位疫苗研制的主要對象。為了了解PCV2在我國的流行現(xiàn)狀以及研制安

2、全、高效的疫苗用于PCV2感染的防治，本課題對PCV2基因工程疫苗進行了探索研究，主要研究內(nèi)容如下： 以河南省豬圓環(huán)病毒陽性仔豬的脾臟為材料，提取病毒DNA，根據(jù)已報道的PCV2序列設(shè)計合成2對引物，應(yīng)用PCR技術(shù)，擴增出豬圓環(huán)病毒野毒株ORF2基因和去信號肽基因命名為CORF2，然后將其克隆于pUCm-T載體中，構(gòu)建克隆載體pUCm-T/CORF2，pUCm-T/ORF2，并進行核苷酸序列測定。 1.對CORF2，OR

3、F2基因進行序列分析后，分別酶切pUCm-T/CORF2，pUCm-T/ORF2得到ORF2和CORF2基因，與原核表達載體pET-32a(+)、pET-41a(+)相連，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a/CORF2、pET-41a(+)/ORF2。 2.重組質(zhì)粒pET-32a/CORF2，pET-41a(+)/ORF2轉(zhuǎn)入宿主菌BLgold(DE3)中，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)進行誘導(dǎo)表達，用SDS-PAGE電泳和

4、Western blotting檢測蛋白表達情況及表達蛋白活性。結(jié)果表明重組質(zhì)粒pET-32a/CORF2能在大腸桿菌中高效表達，其表達的蛋白以包涵體形式存在，表達產(chǎn)物的分子量為38KD左右，與理論推測的蛋白分子量一致。EWestern-blotting及建立的間接ELISA方法檢測，表達的ORF2蛋白可被豬圓環(huán)病毒陽性血清所識別。pET-41a(+)/ORF2也能在大腸桿菌中表達，表達效果不是很好，經(jīng)換載體與表達菌后仍不能高效表達，最

5、后放棄。 3.收集重組質(zhì)粒pET-32a/CORF2誘導(dǎo)表達的菌液，超聲波破碎分離包涵體，TritonX-100和NaCl分別洗滌包涵體，用8mol/L尿素溶解包涵體后經(jīng)Ni-BPA親和層析法純化，獲得了純度較高的目的蛋白，其純度可達80％。每孔以100ng純化的目的蛋白包被酶標(biāo)板進行ELISA檢測，結(jié)果顯示，純化蛋白與PCV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。 4.表達產(chǎn)物經(jīng)純化后，以每只小鼠0.1mg、0.2 mg、0.4mg分