山東PCV2全基因序列分析及含CpG的PCV2ORF2的真核表達載體的構(gòu)建和表達.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine cricovirus type 2，PCV2)為無囊膜的單股環(huán)狀負鏈DNA病毒，屬圓環(huán)病毒科，與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post weaning multisystemicwasting syndrome，PMWS)密切相關(guān)，1991年在加拿大首次暴發(fā)，隨后世界許多國家和地區(qū)流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。 為了在分子水平上揭示山東PCV2流行的來源及遺傳學背景，并為山東省PCV2的防治提供一

2、種安全有效的手段，本研究在課題組對山東省PCV2血清學調(diào)查的基礎(chǔ)上，根據(jù)GenBank中發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)全基因序列(Gene bank accession number：40985(20))，設(shè)計一對特異性引物，用PCR方法直接從在山東地區(qū)采集的血清學檢測為陽性的病料中分別擴增出兩株P(guān)CV2毒株的全基因組，進行了序列測定，分別命名為SD-1株(DQ346683)和SD-2株(DQ478947)，結(jié)果表明，SD-1株全基因

3、組核苷酸長度為1767bp，SD-2株全基因組核苷酸長度為1768 bp。應(yīng)用DNAstar分析表明，本實驗得到的兩株P(guān)CV2的全基因序列與世界上其它地區(qū)的。PCV2分離株的全基因序列同源性高達93.9％-99.7％，ORF1基因序列的同源性為96.9％-99.7％，ORF2基因序列的同源性為91.2％-99.9％。 以PCV2 SD1株(DQ346683)的DNA為PCR模板，擴增得到編碼PCV2結(jié)構(gòu)蛋白的ORF2基因，在課題

4、組對適合豬的CpG-ODN篩選研究的基礎(chǔ)上，將ORF2基因和一段含有18個CpG基序的150bp長的CpG序列分別插入了真核表達載體pVAX1的多克隆位點和骨架結(jié)構(gòu)中，得到了重組真核表達載體pVAX1-ORF2-CpG，并在哺乳動物細胞中對ORF2基因進行了體外表達試驗，用間接免疫熒光方法對表達蛋白的免疫原性進行了初步檢測。結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的含CpG的PCV20RF2的真核表達載體pVAX1-ORF2-CpG在哺乳動物細胞中得到成功