楊樹(shù)單寧合成關(guān)鍵酶基因LARs和ANR的功能分析.pdf

1、單寧是楊樹(shù)體內(nèi)非常重要的一類(lèi)次生代謝化合物,廣泛參與了楊樹(shù)抗病、抗蟲(chóng)、抵御紫外輻射等生理過(guò)程。為了闡明楊樹(shù)中單寧的生物合成代謝途徑,本研究克隆了楊樹(shù)單寧合成途徑中關(guān)鍵酶基因PtrLAR1、PtrLAR3和PtrANR,氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),PtrLAR1、PtrLAR3和PtrANR與其它物種的同源基因具有較高的相似性,進(jìn)化分析結(jié)果表明,PtrLAR1、PtrLAR3和PtrANR與木本植物的同源基因具有較近的親緣關(guān)系。
　　 半

2、定量和熒光定量PCR分析PtrLARs和PtrANR基因的組織特異性發(fā)現(xiàn),它們均在根中大量表達(dá)。對(duì)毛白楊不同組織縮合單寧含量的測(cè)定顯示,縮合單寧也在根中含量最高,這些結(jié)果表明PtrLAR1、PtrLAR3和PtrANR可能參與了縮合單寧的代謝合成。
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證PtrLAR1、PtrLAR3和PtrANR基因的功能,將這些基因分別轉(zhuǎn)化毛白楊,獲得轉(zhuǎn)基因植株。測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株中縮合單寧的含量發(fā)現(xiàn),超量表達(dá)PtrLAR1、Ptr

3、LAR3和PtrANR均導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株中可溶性縮合單寧含量顯著增加,顯示這些基因均參與了單寧的生物合成。
　　 為了檢測(cè)PtrLAR和PtrANR超量表達(dá)是否影響了花青素的合成,我們也檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因植株花青素的含量。發(fā)現(xiàn)在PtrLAR1和PtrANR轉(zhuǎn)基因植株中花青素含量均有明顯降低,該結(jié)果暗示超量表達(dá)PtrLAR1和PtrANR導(dǎo)致縮合單寧含量增加,但影響了花青素的合成。
　　 HPLC測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株中單寧的單體發(fā)現(xiàn),超

4、量表達(dá)PtrANR提高了轉(zhuǎn)基因植物中表兒茶素的含量,而超量表達(dá)PtrLAR1同時(shí)提高了縮合單寧的兩種單體——兒茶素和表兒茶素的含量。
　　 前人研究表明,在擬南芥中未發(fā)現(xiàn)LAR及其同源基因,也未檢測(cè)到兒茶素。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PtrLAR1的功能,將PtrLAR1轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)PtrLAR1擬南芥中檢測(cè)到了兒茶素的大量合成,并且表兒茶素的含量也有所提高,該結(jié)果表明,PtrLAR1能同催化兒茶素和表兒茶

5、素兩種縮合單寧單體的合成。
　　 植物中單寧的存在可提高其抗病性。在毛白楊葉片表面接種黑斑病菌48 h后,數(shù)字表達(dá)譜(DEG)檢測(cè)黃酮代謝途徑上關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),該途徑中大多數(shù)關(guān)鍵酶基因均明顯上調(diào),其中PtrLAR3提高尤為顯著,同時(shí)感染黑斑病的葉片中縮合單寧含量有了明顯提高,推測(cè)PtrLAR3的表達(dá)可能與楊樹(shù)的抗病性相關(guān)。
　　 離體抗病實(shí)驗(yàn)表明,超量表達(dá)PtrLAR3的轉(zhuǎn)基因毛白楊葉片細(xì)胞粗提液能夠抑制黑斑病