小麥葉黃素循環(huán)關(guān)鍵酶基因的表達與功能分析.pdf

1、當植物吸收的光能過剩超過其電子傳遞所需時，過剩光能便會造成光合效率和光合功能的降低，嚴重時還會發(fā)生光氧化破壞。植物在長期的進化過程中形成了多種光保護機制，可將過剩激發(fā)能對光合機構(gòu)的損傷減小到最低程度，其中葉黃素循環(huán)被認為在植物防御光氧化破壞中起著重要作用。所謂的葉黃素循環(huán)是指植物吸收的光能過剩時，雙環(huán)氧的紫黃質(zhì)(V)在紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶(VDE)的催化下，經(jīng)過中間物單環(huán)氧的花藥黃質(zhì)(A)轉(zhuǎn)化為無環(huán)氧的玉米黃質(zhì)(Z)；在暗處，則在玉米黃質(zhì)環(huán)

2、氧化酶(ZE)的作用下朝相反方向進行，將Z經(jīng)A重新環(huán)氧化為V，形成一個循環(huán)。其中紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶(VDE)和玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(ZE)是該循環(huán)的關(guān)鍵酶。因此，弄清葉黃素循環(huán)的功能以及該循環(huán)的調(diào)控機理具有非常重要的意義。 本文以小麥(旱豐9703)為材料，利用RT-PCR克隆了小麥紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因(WVDE)和玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因(WZE)，并分析了兩個基因在小麥中的表達特征。構(gòu)建了WVDE和WZE基因反義表達載體，并轉(zhuǎn)化煙草，

3、探討了轉(zhuǎn)基因煙草耐低溫弱光和強光脅迫能力的變化。主要結(jié)果如下： 1、根據(jù)已知序列設(shè)計特異引物，通過RT-PCR的方法從小麥葉片中克隆了小麥紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶和玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因的中間片段序列。 2、Northern雜交結(jié)果表明，WVDE表達量隨強光和低溫弱光處理時間的延長逐漸增大，6小時達到最大，之后逐漸穩(wěn)定。WZE的表達趨勢與WVDE的相似。不同光強、不同溫度條件下WVDE和WZE表達趨勢基本相同，說明WVDE和WZE

4、在RNA水平的表達不受溫度和光強的影響，而是受到內(nèi)生節(jié)律的調(diào)控。 3、將獲得的小麥紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因和小麥玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因分別與含有35S啟動子的PBI121載體重組，構(gòu)建了反義表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入煙草中，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草。 在低溫弱光及強光脅迫條件下，依賴葉黃素循環(huán)的NPQ能夠耗散過剩激發(fā)能，而轉(zhuǎn)WVDE基因煙草比野生型耗散能力下降；強光處理過程中，與野生型相比轉(zhuǎn)基因煙草的Fv/Fm降低更明顯，且野生型

5、的Fv/Fm恢復(fù)較快，轉(zhuǎn)基因植株恢復(fù)較慢。低溫弱光處理時，野生型和轉(zhuǎn)基因株系Fv/Fm降低程度要小于強光脅迫，但總的變化趨勢基本相同，這表明WVDE的抑制加重了PSII的光抑制程度，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草的PSII反應(yīng)中心受傷害較嚴重；強光脅迫6 h和12 h，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的放氧速率降低非常顯著，低溫弱光處理6 h和12 h，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的放氧速率都降低，但下降程度不如強光處理下的明顯。這表明由于VDE的表達抑制降低了低溫

6、弱光和強光脅迫下放氧復(fù)合體的穩(wěn)定性，使光合機構(gòu)所受到的傷害加重：對野生型和轉(zhuǎn)WZE基因煙草進行同樣的強光和低溫弱光脅迫處理，但兩者之間似乎差別不大。 4、對轉(zhuǎn)WVDE基因植株和野生型煙草的幼葉與成熟葉分別進行northern雜交分析，結(jié)果顯示VDE基因在煙草幼葉當中的表達水平要比成熟葉的高。進一步測定強光脅迫條件下幼葉與功能葉的光合和熒光參數(shù)，幼葉受強光脅迫的影響要比功能葉小的多。膜脂測定結(jié)果顯示，幼葉當中不飽和脂肪酸的含量要稍