野生茄子(Solanum torvum)葉片cDNA文庫構(gòu)建及耐鹽相關(guān)基因StBADH遺傳轉(zhuǎn)化番茄.pdf

1、野生茄子(Solanum torvum Swartz)，原產(chǎn)于印度尼西亞的爪哇島，具有優(yōu)良的抗病性及抗逆性。日本科學家于1986年引種后，經(jīng)過多年選育，已育成茄子設(shè)施栽培上專用耐鹽砧木品種‘Torvum Vigor’。本研究構(gòu)建了野生茄子‘Torvum Vigor’葉片cDNA文庫并分析其EST序列，結(jié)合RT-PCR技術(shù)克隆了耐鹽相關(guān)基因StBADH。將耐鹽相關(guān)基因StBADH用于構(gòu)建抗除草劑植物表達載體pCAMBIA3301-StBA

2、DH-T800，并將其遺傳轉(zhuǎn)化鹽敏感‘金棚一號’番茄，獲得了抗除草劑的轉(zhuǎn)基因番茄植株。主要研究結(jié)果如下:
　　1.以‘Torvum Vigor’葉片為試驗材料，采用改進的SMART(Switchingmechanism at5'-end of RNA transcript)技術(shù)和LD-PCR(Long-distance PCR)方法，利用pBluescriptⅡ SK(+)載體構(gòu)建了cDNA文庫。該文庫初始滴度為3.6×106cf

3、u·mL-1，擴增后文庫滴度達1.2×1010 cfu·mL-1。經(jīng)過藍白斑計數(shù)，文庫的重組率高達99％，平均插入片段長度為0.4-2.5 kb。表明所構(gòu)建的文庫是一個高質(zhì)量的全長cDNA文庫，達到了用于目的基因分離篩選的建庫要求。
　　2.在構(gòu)建的野生茄子葉片cDNA文庫中隨機挑選427個陽性克隆進行測序，獲得的原始序列去除不可讀序列后，共得到364條高質(zhì)量的EST序列，序列遞交NCBI數(shù)據(jù)庫（GenBank登錄號:JK2651

4、31-JK265494）。在已遞交的364條EST序列中，74.72％含有全長編碼區(qū)。BLASTX分析表明62.4％的EST序列與其他物種的一些已報道的蛋白具有很高的同源性，獲得了9個與耐鹽性狀等有關(guān)基因的EST序列（耐鹽相關(guān)基因5個）。
　　3.通過RT-PCR技術(shù)從‘Torvum Vigor’葉片中，克隆了耐鹽相關(guān)基因StBADH（GenBank登錄號:JN812057）。該基因核苷酸序列全長1518 bp，包含1個完整的開放

5、閱讀框，編碼505個氨基酸殘基，推測的蛋白質(zhì)分子量為55.9 kDa，理論等電點為5.42，其氨基酸序列與番茄的同源性達96％。通過系統(tǒng)進化樹分析表明，‘TorvumVigor’甜菜堿醛脫氫酶與同科植物番茄最先聚類。
　　4.利用內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ分別雙酶切pT800質(zhì)粒DNA（含有CaMV35S啟動子、pUC18 Polylinker多克隆位點、Nos終止子）與植物表達載體pCAMBIA3301（含bar），構(gòu)建中間載

6、體pCAMBIA3301-T800。再將StBADH和中間載體pCAMBIA3301-T800分別通過內(nèi)切酶SmaⅠ和XbaⅠ雙酶切，成功地構(gòu)建了抗除草劑植物表達載體pCAMBIA3301-StBADH-T800，并將此質(zhì)粒利用凍融法導入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。
　　5.利用番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）栽培品種‘金棚一號’下胚軸和子葉外植體，研究了不同苗齡和激素配比對不定芽分化及生根的影響。

7、并用根癌農(nóng)桿菌介導法將抗除草劑植物表達載體pCAMBIA3301-StBADH-T800遺傳轉(zhuǎn)化‘金棚一號’番茄。結(jié)果表明:以10d苗齡的下胚軸和子葉在MS+0.2 mg·L-1 ZT+1 mg·L-1 IAA芽誘導培養(yǎng)基上不定芽再生頻率最高，下胚軸為83.3％、子葉為75.6％。MS+0.5mg·L-1 IAA是誘導不定芽生根的理想培養(yǎng)基，7d后生根率為100％。番茄遺傳轉(zhuǎn)化過程中不定芽再生培養(yǎng)基中添加bialaphos的最佳篩選濃度