Bacillus cereus B-02拮抗作用相關(guān)基因的克隆及其表達(dá).pdf

1、蠟樣芽孢桿菌B-02(Bacillus cereus B-02)分離自淄博市郊區(qū)感染灰霉病的大棚蔬菜土壤，是一株具有很強(qiáng)的抗番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)活性的拮抗細(xì)菌。為探討該菌株對Botrytis cinerea的防病機(jī)理，本研究根據(jù)從Bacillus cereus B-02突變體基因組DNA擴(kuò)增到的DJ-TO2基因片段(573 bp)，設(shè)計3條嵌套的特異性引物，與5條短的隨機(jī)簡并引物組成的引物庫，分別用熱不對稱交

2、錯PCR法從Bacillus cereusB-02基因組DNA擴(kuò)增該片段的5’和3’旁側(cè)序列，經(jīng)產(chǎn)物回收、測序、剪切拼接后，得到一段長2344 bp的MZ-BcP序列。 結(jié)合生物信息學(xué)及相關(guān)分析軟件，對MZ-BcP序列進(jìn)行分析，將該序列在Genebank中進(jìn)行blastn同源性比對，發(fā)現(xiàn)該序列與芽孢桿菌(如Bacillus thuringiensis，Bacillus cereus)質(zhì)粒的部分序列同源性較高，同源區(qū)序列編碼蛋白為

3、假定蛋白，具體功能目前尚未有研究。為了進(jìn)一步研究位于Tn917插入位點處的基因與Bacilluscereus B-02具有強(qiáng)拮抗性之間的分子調(diào)控機(jī)制，本研究通過DNAStar等生物信息學(xué)軟件對MZ-BcP序列進(jìn)行開放閱讀框(ORF)的查找，得到5個均包括Tn917插入位點的ORFs，分別為585 bp、498 bp、453 bp、321 bp、99 bp。根據(jù)功能ORFs注釋原則：對于有重疊的ORF，選取與已知基因或蛋白質(zhì)motif/d

4、omain有相似性的或選取較長的ORF，短于150 bp的ORFs，若沒有與已知的蛋白motif/domain具有相似性，則被除去。本研究選用較大的ORF(585 bp)進(jìn)行實驗驗證，并經(jīng)DNAStar翻譯后在NCBI中進(jìn)行blastp比對，得知該翻譯片段與Bacillus thuringiensis質(zhì)粒上的一段復(fù)制蛋白同源性最高，分子量為22.3 kD，推測其可能為與抑菌活性相關(guān)的新基因或調(diào)控因子。 為了進(jìn)一步驗證該片段與Ba