蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）J-,1-拮抗蛋白性質(zhì)及其改良研究.pdf

1、姜瘟病是生姜生產(chǎn)中普遍發(fā)生的一種毀滅性土傳病害，是由青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacerum)引起的一種細(xì)菌性青枯病。從姜瘟病發(fā)病田塊分離到的蠟狀芽孢桿菌J<,1>，對(duì)姜瘟病病原菌有很好拮抗作用，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。 將拮抗菌J<,1>在30℃，120r/min發(fā)酵培養(yǎng)55h后，以60％飽和度的硫酸銨提取發(fā)酵液中的拮抗蛋白，采用環(huán)柱測(cè)定法測(cè)定了拮抗蛋白對(duì)膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeospor

2、ioides)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)等8種病原菌的拮抗譜，結(jié)果表明拮抗蛋白對(duì)西瓜枯萎病菌(Fusarium.oxysporum fsp.niveum)、玉米枯萎病菌(Fusarium.oxysporum f sp.zeae)有很好的拮抗活性，拮抗帶寬度達(dá)到10～15mm，對(duì)膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)等其它6種病原菌也有較好的拮抗活性。 拮

3、抗蛋白經(jīng)不同因素處理的試驗(yàn)得出，拮抗蛋白經(jīng)40～80"C溫度范圍內(nèi)處理后.有較好的拮抗活性，100℃處理30min后拮抗活性喪失；經(jīng)不同pH值處理后，在pH4～8都具有活性，中性pH條件下活性最強(qiáng)；在不同光源照射條件下，直接光照及紫外線照射對(duì)J<,1>菌株活性物質(zhì)的拮抗活性影響不大，與黑暗條件下保存相比，拮抗活性沒有改變，可見該拮抗活性物質(zhì)為光穩(wěn)定性物質(zhì)；拮抗蛋白經(jīng)胰蛋白酶(100mg/mL)在37℃下處理90min后，環(huán)柱法測(cè)定未見拮

4、抗圈，說明拮抗蛋白被酶解，活性消失。 通過pH8.0，200mmol/LTris-HCl緩沖液平衡Econo-Pac Q離子交換柱，以2mL/min的流速，0～1：mol/L的NaCl的緩沖溶液，梯度式洗脫以純化拮抗拮抗蛋白，通過生物活性測(cè)定和SDS-PAGE分析表明純化得到的拮抗蛋白表觀分子量為45KD。 采用多種方法對(duì)拮抗菌J<,1>進(jìn)行誘變改良，紫外線(UV)誘變?cè)囼?yàn)結(jié)果表明，在60s～90s時(shí)間范圍，致死率80％

5、～90％的條件下能夠取得較為理想的誘變效果；甲基磺酸乙脂(EMS)誘變?cè)囼?yàn)結(jié)果表明，采取低劑量長(zhǎng)時(shí)間處理，可以達(dá)到高正突變率，獲得多株高產(chǎn)菌株的目的；UV誘變和氯化鋰(Licl)的復(fù)合誘變結(jié)果表明，UV60s和1.2％濃度的Licl復(fù)合誘變效果最好；而吖啶橙對(duì)出發(fā)菌株的誘變效果很差，沒有得到正突變菌株。通過多次篩選得到改良菌株EMS-2，其發(fā)酵液的蛋白質(zhì)效價(jià)為22.79ug/mL較出發(fā)菌株的蛋白質(zhì)效價(jià)17.84ug/mL提高了30.38

6、％。 將EMS-2菌株通過原生質(zhì)體的形式，進(jìn)一步進(jìn)行誘變改良。試驗(yàn)得出原生質(zhì)體制備的最佳條件為，溶菌酶濃度0.5mg/mL，30℃條件下處理30min。從EMS-2原生質(zhì)體的紫外線(UV)誘變結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60s前原生質(zhì)體經(jīng)紫外線照射的致死率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于拮抗菌J<,1>經(jīng)紫外線照射時(shí)的致死率，與試驗(yàn)預(yù)期相反，這可能與高滲溶液的保護(hù)有關(guān)。紫外線照射在50s時(shí)正突變率達(dá)到最大(為35．8％較拮抗菌J<,1>在紫外線誘變條件下的最高突變率高1