入侵生物李屬壞死環(huán)斑病毒檢測(cè)鑒定及多抗制備.pdf

1、李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunu.necroti.ringspo.virus，PNRSV)是我國(guó)農(nóng)業(yè)和進(jìn)境檢疫性有害生物，可侵染多種果樹、花卉及經(jīng)濟(jì)作物。浙江省是重要的核果類果樹和花卉基地，對(duì)該病毒的發(fā)生危害等情況缺乏了解，而且目前國(guó)內(nèi)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)用的PNRSV抗血清產(chǎn)品完全依賴進(jìn)口?；诖?，本研究從發(fā)病區(qū)北京、西安和昆明等地采集病葉進(jìn)行分子和免疫檢測(cè)的基礎(chǔ)上，以櫻桃、桃、月季等易感寄主植物大量集中種植的杭州周邊地區(qū)為代表，取樣調(diào)查該病毒在

2、浙江省的發(fā)生情況；并以上述4省獲得的不同分離株為材料，進(jìn)行該病毒分子生態(tài)相關(guān)的鑒定分析，進(jìn)而構(gòu)建該病毒CP蛋白重組表達(dá)菌，純化融合蛋白并制備了多克隆抗體，為建立分子與免疫學(xué)相結(jié)合的PNRSV的檢測(cè)體系奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究采用DAS-ELISA和RT-PCR方法，檢測(cè)了4個(gè)北京昌平和3個(gè)陜西西安的櫻桃樣品，3個(gè)云南昆明的月季樣品，陽(yáng)性檢測(cè)率分別為25％、100％和66.7％。在此基礎(chǔ)上，采用DAS-ELISA法對(duì)杭州周邊地區(qū)包

3、括杭州、諸暨、海寧的果木園林植物進(jìn)行PNRSV的疫情調(diào)查，檢測(cè)樣品包括櫻桃、桃、李和月季等共計(jì)96個(gè)，結(jié)果在海寧的10個(gè)樣品上檢測(cè)到PNRSV，檢出率高達(dá)71.4％，田間發(fā)病率達(dá)19.5％，已嚴(yán)重威脅海寧花卉基地的生產(chǎn)安全。
　　 測(cè)定了北京、昆明、西安三個(gè)PNRSV分離物的CP基因，并測(cè)定了海寧分離物RNA3全長(zhǎng)序列。北京分離物的CP基因?yàn)?7.nt編碼22.aa，海寧、昆明和西安分離物的CP基因均為68.nt編碼22.aa。

4、海寧PNRSV分離物RNA3全長(zhǎng)195.nt，編碼2個(gè)蛋白即85.nt的MP基因和68.nt的CP基因。其余各部分，5’-UTR含17.nt，3’-UTR含17.nt，基因間隔序列含7.nt。4個(gè)分離物CP基因之間具有很高的同源性，各個(gè)分離物間的核苷酸同源性在94.8％-99.3％之間，氨基酸同源性在94.2％-98.7％之間。CP基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹(UPGMA法)結(jié)果表明，北京分離物屬于Grou.II組，昆明、西安和海寧分離物屬

5、于Grou.I組。北京分離物與Grou.II組分離物的相似性高于98.2％，與Grou.I組和GroupⅢ組分離物相似性在88.9％-95.4％之間；昆明分離物與Grou.I組分離物的相似性高于96.8％，而與Grou.II組和GroupIII組分離物相似性在88.7％-95.4％之間；西安分離物與Grou.I組分離物的相似性高于97.2％，而與Grou.II組和Grou.III組分離物相似性在89.5％-96.1％之間；海寧分離物與G

6、rou.I組分離物的相似性高于97.4％，而與Grou.II組和Grou.III組分離物相似性在89.2％-96.7％之間。對(duì)海寧分離物MP蛋白氨基酸序列的研究表明，海寧分離物屬于CH9血清型。北京和西安分離物與CH9血清型溫和型株系較接近，而昆明分離物的致病型尚無(wú)法確定。
　　 以pQE-30為質(zhì)粒和大腸桿菌SG13009為宿主菌構(gòu)建了PNRS.CP表達(dá)重組菌，得到了純度大于95％的融合蛋白，并制備了多克隆抗體。經(jīng)wester