皮膚黑素瘤細(xì)胞IGFBP7基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常甲基化的研究.pdf

1、皮膚黑素瘤是一種高度惡性的皮膚腫瘤，其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7（insulin-like growth factor binding protein 7，IGFBP7）的表達(dá)受抑制是黑素瘤發(fā)生的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，抑癌基因的表達(dá)異常與DNA異常甲基化相關(guān)，本課題的目的是研究皮膚黑素瘤細(xì)胞中IGFBP7基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，重點(diǎn)闡明啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常甲基化對(duì)IGFBP7基因表達(dá)調(diào)控的影響。

2、　　 1 IGFBP7在皮膚黑素瘤組織和人黑素瘤細(xì)胞株中的表達(dá)
　　 應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IGFBP7蛋白在原發(fā)性皮膚黑素瘤和轉(zhuǎn)移性黑素瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于普通良性色素痣組織，有顯著性差異。應(yīng)用半定量RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IGFBP7mRNA和蛋白在人黑素瘤細(xì)胞株A375、M14和SK-MEL-1中均陰性表達(dá)，在原代黑素細(xì)胞和人黑素瘤細(xì)胞株MV3中陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果顯示，IGFBP7在皮膚黑素瘤組織和人黑

3、素瘤細(xì)胞株中表達(dá)抑制。
　　 2人黑素瘤細(xì)胞株IGFBP7基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常甲基化的研究
　　 應(yīng)用亞硫酸氫鈉修飾后測(cè)序法（bisulfite sequencing PCR，BSP）檢測(cè)人黑素瘤細(xì)胞株A375、M14、SK-MEL-1、MV3和原代黑素細(xì)胞中IGFBP7基因啟動(dòng)予區(qū)CpG島所有CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示，在IGFBP7表達(dá)陰性和陽(yáng)性的細(xì)胞之間存在顯著的甲基化差異。
　　 35-aza-

4、dC對(duì)人黑素瘤A375、M14細(xì)胞IGFBP7的表達(dá)及生物學(xué)行為的影響
　　 應(yīng)用去甲基化藥物5-aza-dC處理陰性表達(dá)IGFBP7的A375和M14細(xì)胞，藥物處理后，2株細(xì)胞IGFBP7mRNA和蛋白均恢復(fù)表達(dá)，且BSP檢測(cè)證實(shí)了該基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生了去甲基化改變，驗(yàn)證了IGFBP7在這2株細(xì)胞中的表達(dá)恢復(fù)是該基因去甲基化的直接作用，表明啟動(dòng)子區(qū)CpG島DNA異常甲基化是黑素瘤細(xì)胞IGFBP7表達(dá)改變的直接調(diào)控機(jī)制。
　

5、　 經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL法和transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，5-aza-dC在體外抑制A375和M14細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，并導(dǎo)致細(xì)胞周期出現(xiàn)G1期阻滯，抑制細(xì)胞侵襲。結(jié)合藥物處理后IGFBP7的表達(dá)變化，推測(cè)IGFBP7表達(dá)的恢復(fù)，很可能參與了5-aza-dC處理所引起的黑素瘤細(xì)胞上述生物學(xué)行為的改變。
　　 以上研究結(jié)果說(shuō)明，IGFBP7基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島DNA異常甲基化是黑素瘤細(xì)胞中IGFBP7表