大豆疫霉Ras GTPase蛋白PsARF1的功能研究.pdf

1、大豆是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，大豆疫霉（Phytophthorasojae）能夠侵染大豆引起幼苗猝倒和成株的根腐病，給世界的大豆產(chǎn)業(yè)帶來了巨額的經(jīng)濟(jì)損失。該菌的無(wú)性生活史對(duì)于病害在大田里迅速流行起著重要的作用，隨著大豆疫霉全基因組測(cè)序的完成，研究者可以在分子水平上對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄模式進(jìn)行研究分析，為完善人們對(duì)大豆疫霉分子致病機(jī)制的了解提供了新的研究方法。大豆疫霉在侵染植物的過程中會(huì)產(chǎn)生大量的效應(yīng)分子來破壞植物的抗病性，而植物則會(huì)通過抗病基

2、因識(shí)別這些效應(yīng)分子做出反應(yīng)，明確這些效應(yīng)分子從大豆疫霉細(xì)胞內(nèi)到細(xì)胞外的分泌途徑十分重要。囊泡運(yùn)輸是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的一種基本運(yùn)輸方式,想據(jù)其衣被蛋白的不同分為COPⅠ、COPⅡ和網(wǎng)格蛋白衣被囊泡三種，COPⅠ衣被囊泡主要負(fù)責(zé)高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的物質(zhì)運(yùn)輸。ARF1是小G蛋白R(shí)as家族的成員，它是COPⅠ衣被囊泡形成所不可缺少的，也是膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程的重要調(diào)控因子。
　　本文利用生物信息學(xué)方法在大豆疫霉基因組中預(yù)測(cè)到了編碼ARF1的基因，通過分

3、析發(fā)現(xiàn)該基因在進(jìn)化過程中是高度保守的。對(duì)這個(gè)基因在大豆疫霉5個(gè)無(wú)性發(fā)育階段和5個(gè)侵染階段的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)它在這十個(gè)階段都有表達(dá)，但在侵染階段具有較高的轉(zhuǎn)錄水平，該結(jié)果說明PsARF1在大豆疫霉侵染過程中發(fā)揮了重要作用。
　　本研究通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法在大豆疫霉菌P6497(race2)中對(duì)PsARF1進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，篩選到3個(gè)沉默突變體。用沉默突變體接種大豆黃化苗下胚軸可觀察到突變體致病能力明顯減弱，且病斑在創(chuàng)

4、傷和非創(chuàng)傷大豆黃化苗下胚軸上的擴(kuò)展能力都受到一定的抑制，通過顯微觀察證實(shí)沉默突變體菌絲穿透黃化苗表皮層的能力和在細(xì)胞間擴(kuò)展的能力較野生型明顯減弱，說明PsARF1在大豆疫霉侵染寄主的過程中發(fā)揮了重要作用。通過對(duì)沉默突變體的表型分析發(fā)現(xiàn)PsARF1的沉默會(huì)影響菌落的生長(zhǎng)速率及休止孢的萌發(fā)，但并不會(huì)影響其細(xì)胞壁的完整性。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)沉默突變體清除過氧化氫及胼胝質(zhì)的能力明顯減弱，說明PsARF1的沉默能影響大豆疫霉對(duì)植物基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)的