低溫脅迫下草菇抗氧化應(yīng)答反應(yīng)中關(guān)鍵酶的表達(dá)量變化及活性研究.pdf

1、草菇是一種喜高溫高濕的熱帶，亞熱帶的食用菌，營(yíng)腐生性生長(zhǎng)在一些富含纖維素的有機(jī)質(zhì)上。草菇適宜在高溫下生長(zhǎng)，不能耐受低溫。在5℃以下，草菇菌絲內(nèi)蛋白質(zhì)降解，迅速的自溶死亡，子實(shí)體會(huì)軟化，褐變，最后液化腐爛。這種特性給草菇的栽培，儲(chǔ)藏，運(yùn)輸造成不利影響。因此研究草菇的低溫應(yīng)答機(jī)制對(duì)培育，篩選耐低溫的草菇品種具有重要的意義。
　　實(shí)驗(yàn)材料為低溫敏感型草菇菌株V23和較耐低溫的草菇菌株VH3。將兩株草菇菌株的菌絲分別在冰浴條件下處理0，2

2、，4，6，8h，收集菌絲然后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):(1)測(cè)定反應(yīng)細(xì)胞受傷害程度的指標(biāo)—電導(dǎo)率，丙二醛含量以及草菇菌絲的恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)間和菌絲長(zhǎng)速，以確定兩株菌株耐低溫能力的差異性;(2)通過RT-PCR技術(shù)對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)中清除活性氧的關(guān)鍵酶(Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，CAT，GR)的基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析;(3)對(duì)關(guān)鍵抗氧化酶(Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，CAT，GR)的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析，并測(cè)定了這些抗氧化酶(SOD

3、，CAT，APX，GR)的活性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:
　　1、兩株草菇菌株菌絲的電導(dǎo)率變化趨勢(shì)一致。在低溫脅迫的0-2h內(nèi)，電導(dǎo)率上升速度最快，在2-6h內(nèi)，相對(duì)電導(dǎo)率值保持穩(wěn)定，在6-8h又出現(xiàn)上升。在整個(gè)低溫脅迫過程中，草菇菌株VH3的相應(yīng)的電導(dǎo)率值小于V23，說明草菇菌株VH3菌株比V23能夠更好的保持細(xì)胞膜的完整性，受到的傷害小。
　　2、低溫脅迫的時(shí)間越長(zhǎng)，草菇菌絲恢復(fù)生長(zhǎng)所需的時(shí)間就越長(zhǎng)，恢復(fù)生長(zhǎng)的速度就越

4、慢。草菇菌株V23的菌絲恢復(fù)生長(zhǎng)所需時(shí)間比VH3長(zhǎng)，并且菌絲長(zhǎng)速比VH3慢。低溫脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，菌絲的恢復(fù)生長(zhǎng)的時(shí)間和長(zhǎng)速差異就越明顯。
　　3、在低溫脅迫的0-2h中，VH3菌株的丙二醛(MDA)變化不明顯，V23菌株的MDA含量上升。但是在低溫脅迫的2-4h期間，菌株VH3的菌絲中MDA含量上升較快，并在低溫脅迫的4-8h期間，兩株菌株之間的MDA的含量幾乎沒有差異。
　　4、將獲得的草菇的抗氧化酶(Cu/Zn-SOD，M

5、n-SOD，CAT，GR)的氨基酸序列與與其他真菌中確定功能的這些酶的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果證實(shí)草菇這四種酶的氨基酸序列與真菌相應(yīng)的酶具有較高的同源性。保證了以這些抗氧化酶的堿基序列為基礎(chǔ)的基因定量的正確性。
　　5、銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）基因的相對(duì)表達(dá)量在兩株草菇菌株之間的表達(dá)量差異較小，低溫處理期間總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，在VH3中的相對(duì)表達(dá)量略高于V23。低溫脅迫下的草菇菌株VH3

6、中錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的基因相對(duì)表達(dá)量先上升后下降，在草菇菌株V23中表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，該基因在VH3中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于V23。SOD活性先上升后下降，低溫脅迫0-4h階段，菌株VH3中SOD的活性高于菌株V23，但是后期VH3菌株的SOD活性下降較快。說明VH3菌株比V23菌株能夠耐受低溫可能與SOD的表達(dá)有關(guān)，尤其是Mn-SOD。
　　6、兩株草菇的過氧化氫酶(CAT)基因的相對(duì)表達(dá)量都是先下降然后上升的趨勢(shì)，但是

7、VH3菌株的CAT基因的相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于V23菌株。CAT的活性在低溫脅迫期間總體呈上升的趨勢(shì)，而且VH3的CAT活性上升速度高于V23菌株，VH3菌株的CAT能夠更有效的清除H2O2。
　　7、抗壞血酸過氧化物酶(APX)也是清除H2O2的重要的酶。APX的活性在兩株草菇菌株中的活性先上升后下降，菌株之間的APX活性幾乎沒有差異，APX可能不是兩株菌株低溫耐受性差異的原因。
　　8、低溫脅迫期間，GR基因的相對(duì)表達(dá)量呈先