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文檔簡介
1、本研究利用純化的病毒性出血性敗血癥病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)以及原核表達(dá)的VHSV核蛋白作為免疫原,分別制備了抗VHSV全病毒的單克隆抗體以及抗核蛋白的多克隆抗體,并利用單克隆抗體建立了VHSV雙抗體夾心ELISA檢測方法。試驗結(jié)果如下:
1.VHSV單克隆抗體的制備及VHSV雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立
用純化的VHSV免疫BALB/c小鼠,
2、取其脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合,間接ELISA方法篩選陽性孔,再經(jīng)有限稀釋法對其進(jìn)行克隆,篩選出1株能夠穩(wěn)定分泌抗VHSV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為2E9。用2E9注射小鼠制備腹水單克隆抗體,ELISA方法測定腹水抗體效價為1:160000。亞型鑒定表明,2E9腹水單克隆抗體為IgG2b亞類,其輕鏈為κ鏈。純化后的2E9腹水單克隆抗體主要包括大小約為50 ku的重鏈和25 ku的輕鏈。交叉實驗結(jié)果表明,2E9腹水單克隆抗體只能與V
3、HSV發(fā)生特異性結(jié)合,與傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)等均無交叉反應(yīng),具有較好的特異性。間接免疫熒光試驗結(jié)果表明,2E9腹水單克隆抗體能與VHSV發(fā)生特異性結(jié)合,產(chǎn)生綠色熒光。Western blot分析表明,2E9腹水單克隆抗體能特異性地與VHSV的核蛋白結(jié)合。利用制備的2E9腹水單克隆抗體與羊抗VHSV陽性血清建立了VHSV雙抗體夾心ELISA檢測
4、方法。結(jié)果表明,將濃度為2.5 mg/mL的純化的2E9單抗腹水,按1:800倍稀釋為最佳的單抗包被濃度,而羊抗VHSV血清工作濃度為1:400。經(jīng)驗證,建立的雙抗體夾心ELISA法對IHNV等3種病毒的檢測結(jié)果均為陰性,表明該方法具有良好的特異性。該法能特異性識別VHSV,檢測限約為40 ng/mL,具有較高的靈敏度。
2.VHSV核蛋白基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PC
5、R)獲得了編碼VHSV核蛋白基因,將其克隆至原核表達(dá)載體pET28a,并在E.coli BL21(DE3)中得到了表達(dá),用SDS-PAGE與Western blot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,通過RT-PCR擴增獲得長度為1221bp核蛋白基因片段,誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-N,經(jīng)SDS-PAGE檢測,IPTG終濃度為1 mmol/L時,誘導(dǎo)5h蛋白表達(dá)量最高,獲得的目的蛋白大小與N蛋白的預(yù)測分子質(zhì)量一致,約為48 ku。誘導(dǎo)后的
6、菌液進(jìn)行超聲波破碎后,將沉淀和上清分別用于SDS-PAGE電泳,結(jié)果表明目的蛋白主要以包涵體的形式存在。表達(dá)蛋白經(jīng)過復(fù)性、純化,得到了較高純度的可溶性蛋白。經(jīng)Western blot檢測表明,該表達(dá)產(chǎn)物能被羊抗VHSV陽性血清特異性識別。利用表達(dá)的核蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體,間接ELISA法檢測表明獲得的鼠抗VHSV核蛋白血清效價為1:32000,與VHSV病毒懸液反應(yīng)強烈。Western blot分析結(jié)果顯示,在48 ku處出現(xiàn)一條
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