魚類病毒性出血性敗血癥病毒單克隆抗體的制備及其核蛋白基因的原核表達(dá).pdf

1、本研究利用純化的病毒性出血性敗血癥病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV)以及原核表達(dá)的VHSV核蛋白作為免疫原，分別制備了抗VHSV全病毒的單克隆抗體以及抗核蛋白的多克隆抗體，并利用單克隆抗體建立了VHSV雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.VHSV單克隆抗體的制備及VHSV雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立
　　 用純化的VHSV免疫BALB/c小鼠，

2、取其脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，再經(jīng)有限稀釋法對(duì)其進(jìn)行克隆，篩選出1株能夠穩(wěn)定分泌抗VHSV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2E9。用2E9注射小鼠制備腹水單克隆抗體，ELISA方法測(cè)定腹水抗體效價(jià)為1:160000。亞型鑒定表明，2E9腹水單克隆抗體為IgG2b亞類，其輕鏈為κ鏈。純化后的2E9腹水單克隆抗體主要包括大小約為50 ku的重鏈和25 ku的輕鏈。交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2E9腹水單克隆抗體只能與V

3、HSV發(fā)生特異性結(jié)合，與傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)等均無(wú)交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明，2E9腹水單克隆抗體能與VHSV發(fā)生特異性結(jié)合，產(chǎn)生綠色熒光。Western blot分析表明，2E9腹水單克隆抗體能特異性地與VHSV的核蛋白結(jié)合。利用制備的2E9腹水單克隆抗體與羊抗VHSV陽(yáng)性血清建立了VHSV雙抗體夾心ELISA檢測(cè)

4、方法。結(jié)果表明，將濃度為2.5 mg/mL的純化的2E9單抗腹水，按1:800倍稀釋為最佳的單抗包被濃度，而羊抗VHSV血清工作濃度為1:400。經(jīng)驗(yàn)證，建立的雙抗體夾心ELISA法對(duì)IHNV等3種病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明該方法具有良好的特異性。該法能特異性識(shí)別VHSV，檢測(cè)限約為40 ng/mL，具有較高的靈敏度。
　　 2.VHSV核蛋白基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
　　 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PC

5、R)獲得了編碼VHSV核蛋白基因，將其克隆至原核表達(dá)載體pET28a，并在E.coli BL21(DE3)中得到了表達(dá)，用SDS-PAGE與Western blot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為1221bp核蛋白基因片段，誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-N，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，IPTG終濃度為1 mmol/L時(shí)，誘導(dǎo)5h蛋白表達(dá)量最高，獲得的目的蛋白大小與N蛋白的預(yù)測(cè)分子質(zhì)量一致，約為48 ku。誘導(dǎo)后的

6、菌液進(jìn)行超聲波破碎后，將沉淀和上清分別用于SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明目的蛋白主要以包涵體的形式存在。表達(dá)蛋白經(jīng)過(guò)復(fù)性、純化，得到了較高純度的可溶性蛋白。經(jīng)Western blot檢測(cè)表明，該表達(dá)產(chǎn)物能被羊抗VHSV陽(yáng)性血清特異性識(shí)別。利用表達(dá)的核蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體，間接ELISA法檢測(cè)表明獲得的鼠抗VHSV核蛋白血清效價(jià)為1:32000，與VHSV病毒懸液反應(yīng)強(qiáng)烈。Western blot分析結(jié)果顯示，在48 ku處出現(xiàn)一條