兔出血癥病毒單克隆抗體的制備及標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清的研制.pdf

1、兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD）是兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種急性、致死性、高度接觸性傳染病。主要發(fā)病于3月齡以上的成年兔，以引起呼吸系統(tǒng)出血，實(shí)質(zhì)器官出血、肝臟腫大、淤血、壞死為特點(diǎn)。RHDV最早于1984年爆發(fā)于中國(guó)江蘇無(wú)錫，之后蔓延全國(guó)以及全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。本研究中利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)RHDV-VP60分別作為免疫抗原和篩選抗原，研制了3株針對(duì)RHDV-VP60蛋白

2、的單克隆抗體，并用這些單克隆單體建立了針對(duì)RHDV-VP60的雙夾心ELISA方法;同時(shí)應(yīng)用RHDV-WX84株感染非免疫成年兔，制備了RHDV抗原和多抗血清，并對(duì)抗原和抗體進(jìn)行了一系列的鑒定和標(biāo)定，獲得了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)血清，為RHDV的血凝和血凝抑制方法提供了有效的方法和材料。
　　1、兔出血癥病毒單克隆抗體的研制
　　參考genbank中的RHDV WX84毒株VP60的序列（登錄號(hào):AF402614）設(shè)計(jì)針對(duì)VP6

3、0的特異性引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增本實(shí)驗(yàn)室保存的RHDV VP60質(zhì)粒。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接pGEX-6P-1構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-VP60，測(cè)序正確后，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，結(jié)果獲得了大小約87KD的重組蛋白GST-VP60，利用GST親和柱對(duì)重組蛋白GST-VP60進(jìn)行純化。SDS-PAGE和Western-Blot結(jié)果表明，純化后的融合蛋白GST-VP60雜條帶少且具有良好的抗原性。
　　以

4、重組桿狀病毒pBlueBacHis2B-VP60感染后的sf9細(xì)胞作為免疫原，按照常規(guī)程序免疫6-8周齡Balb/c小鼠，取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合。利用上述重組蛋白GST-VP60包被ELISA板，進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(iELISA)篩選陽(yáng)性細(xì)胞株，最終獲得了3株針對(duì)RHDV-VP60蛋白單克隆抗體的陽(yáng)性細(xì)胞株，分別命名為:RHDV-VP60-2H6、RHDV-VP60-4H8、RHDV-VP60-6H5。Western-Blo

5、t與間接免疫熒光(IFA)鑒定結(jié)果表明，所得三株單抗均能與RHDV WX84株天然病毒發(fā)生特異性反應(yīng)。亞類鑒定結(jié)果顯示RHDV-VP60-2H6株單抗為IgG1，RHDV-VP60-4H8和RHDV-VP60-6H5株單抗為IgG2a，輕鏈型均為Kappa。利用親和層系技術(shù)分別純化了3株單抗腹水，SDS-PAGE顯示獲得了高純度的單克隆抗體，為今后建立RHDV檢測(cè)方法提供了良好的生物試劑。
　　2、兔出血癥病毒雙夾心ELISA檢測(cè)

6、方法的初步建立
　　利用研究?jī)?nèi)容一已經(jīng)獲得的3株針對(duì)RHDV-VP60蛋白的單克隆抗體分別進(jìn)行交叉配對(duì)實(shí)驗(yàn)，最終確定RHDV-VP60-2H6為捕捉抗體，RHDV-VP60-4H8E酶標(biāo)抗體，建立了一種針對(duì)RHDV的雙夾心ELISA檢測(cè)方法，并對(duì)捕捉抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度，待檢樣品和酶標(biāo)抗體的最佳孵育時(shí)間，底物作用時(shí)間以及最低檢測(cè)病毒量進(jìn)行了優(yōu)化，建立了兔出血癥病毒雙夾心ELISA檢測(cè)方法，該方法的建立為臨床檢測(cè)RHDV奠定了基

7、礎(chǔ)。
　　3、兔出血癥病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原及標(biāo)準(zhǔn)抗體的研制
　　本研究將RHDV WX84株病毒皮下注射普通級(jí)非免疫成年兔，取病死兔肝臟進(jìn)行研磨，離心取上清，經(jīng)甲醛滅活后過(guò)濾、分裝，凍干。對(duì)制備的抗原進(jìn)行純粹性、特異性鑒定以及血凝效價(jià)測(cè)定。結(jié)果顯示該樣本中含有RHDV抗原，不含有實(shí)驗(yàn)室中常見(jiàn)的能凝集人O型紅細(xì)胞的NDV、AIV等病毒抗原;樣本HA效價(jià)為210。對(duì)制備抗原凍干品進(jìn)行了物理性狀，計(jì)算裝量差異系數(shù)(CV)檢查，以及支原體檢

8、驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)、凍干前后血凝效價(jià)、穩(wěn)定性、均一性以及長(zhǎng)期保存等一系列特性的標(biāo)定，最終研制出兔出血癥病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性抗原。
　　將滅活的病毒皮下注射4只普通級(jí)非免疫成年兔，第7天任取一只，耳動(dòng)脈無(wú)菌采血，分離血清，制備弱陽(yáng)性血清，再用未滅活的病毒以滴鼻方式攻毒加強(qiáng)免疫2次，在第50天，心臟無(wú)菌采血，分離血清。制得的血清經(jīng)過(guò)高嶺土和50％的人O型紅細(xì)胞處理，加入硫柳汞，分裝凍干。血凝抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究制備獲得的抗RHDV血清血凝抑制價(jià)為