三種夜蛾β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶和蛻皮激素接受子3基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、昆蟲蛻皮是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中有多種酶、激素和受體分子參與其中，本研究對(duì)其中分解體壁和中腸圍食膜幾丁質(zhì)的β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶以及一種蛻皮激素受體.蛻皮激素接受子3進(jìn)行了初步研究。
　　 幾丁質(zhì)是由N-乙酰氨基葡萄糖胺以β-1，4糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，在自然界中是僅次于纖維素的第二大可再生自然資源。廣泛分布于無(wú)脊椎動(dòng)物的外骨骼和角質(zhì)層，同時(shí)在真菌和藻類的細(xì)胞壁中大量存在。β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶是昆蟲幾

2、丁質(zhì)代謝中一種關(guān)鍵酶，在昆蟲的多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。
　　 本研究針對(duì)昆蟲β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因時(shí)序性表達(dá)的特點(diǎn)，確定了在其活性較高的預(yù)蛹時(shí)期來(lái)提取mRNA，進(jìn)一步通過(guò)RT-PCR、RACE等技術(shù)克隆了小地老虎的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶cDNA并且分析了它的分子特性，同時(shí)構(gòu)建原核表達(dá)載體，完成小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。
　　 小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶cDNA序列

3、含有2579個(gè)堿基，包括一個(gè)1788個(gè)堿基的開放閱讀框，編碼一個(gè)含595個(gè)氨基酸的多肽，分子量約為68.3 kDa，等電點(diǎn)為5.48。獲得的小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因cDNA序列已經(jīng)登錄GenBank并獲得登錄號(hào)GU985280。
　　 利用Expasy molecular biology server的Scanprosite facility對(duì)推導(dǎo)的小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶氨基酸的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其最

4、顯著的特點(diǎn)是含有兩個(gè)高度保守區(qū)：一是在氨基酸序列的N-端含有一個(gè)Glycosyl hydrolases family20區(qū)，另一個(gè)是在C-端220個(gè)氨基酸附近有一個(gè)Glycosyl hydrolases family20 catalytic domain區(qū)。這兩個(gè)保守區(qū)在GH20家族其他成員中均有發(fā)現(xiàn)。推導(dǎo)得到的小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶氨基酸序列含有三個(gè)N-位糖基化位點(diǎn)和一個(gè)O-位糖基化位點(diǎn)。
　　 與其他昆蟲β-N-乙

5、酰葡糖胺糖苷酶同源性比較結(jié)果顯示：它們的cDNA序列和氨基酸高度同源。以上結(jié)果表明我們克隆的基因是一條新的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因。
　　 將小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因與表達(dá)載體pTYB11重組，經(jīng)異丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)，在菌體中檢測(cè)到融合蛋白。
　　 蛻皮激素接受子3（hormone receptor3，HR3），是一種蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控蛻皮過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)，是蛻皮級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)

6、鍵因子。本研究以八字地老虎和粘蟲預(yù)蛹期幼蟲為材料，分別提取總RNA，利用RT-PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE），分別擴(kuò)增得到兩種昆蟲蛻皮激素接受子3（HR3）的5’非編碼區(qū)和完整開放讀碼框在內(nèi)的cDNA序列，其中八字地老虎的HR3 cDNA序列含有1729個(gè)堿基，包括一個(gè)1533個(gè)堿基的開放閱讀框，編碼一個(gè)含510個(gè)氨基酸的蛋白，分子量約為57.5kDa。粘蟲的HR3 cDNA序列含有1743個(gè)堿基，包括一個(gè)1536個(gè)堿基的