葡萄籽原花青素對內(nèi)皮細(xì)胞直接作用及對糖基化損傷內(nèi)皮細(xì)胞的影響.pdf

1、第一部分葡萄籽原花青素對內(nèi)皮細(xì)胞的直接作用 背景：動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是危害人體生命健康最嚴(yán)重的疾病之一，會造成血管舒縮性降低、管腔變窄甚至阻塞以及血栓形成等病理改變，導(dǎo)致各種急性心血管事件的發(fā)生。血管內(nèi)皮損傷和功能障礙與動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，它是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)，是多種心血管疾病產(chǎn)生和惡化的基礎(chǔ)。葡萄籽原花青素(grape seed procyanidin，GPC)是從葡萄籽中提取出

2、來的一類多酚化合物，它具有極強(qiáng)的抗氧化等活性，因此被稱為天然的抗氧化劑。但有研究報(bào)道，許多抗氧化劑同時(shí)也表現(xiàn)為促氧化作用，從而損傷機(jī)體。我們的研究通過不同濃度GPC作用體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)不同時(shí)間，觀察GPC對HUVEC的作用，旨在探討GPC對內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷的濃度范圍以及時(shí)間范圍，為臨床的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的：不同濃度GP

3、C作用HLJVEC不同時(shí)間，觀察(1)四甲基偶氮唑鹽法(methylthiazolyl tetFazolium，MTT)檢測GPC對HLJVEC增殖活力的影響；(2)ELISA法測定培養(yǎng)液中內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物血管性假血友病因子(Von willel3rarld factor，vWF)的生成量，研究高濃度GPC對HUVEC的損傷作用；(3)硝酸還原酶法測定培養(yǎng)液中一氧化氮(nitric oxide，NO)的含量。 方法：采用體外

4、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbilical veinendothelial cells，HUVEC)，以不同濃度的GPC(10 mg/l、50 mg/l、100 mg/l、200 mg/l、400 mg/l、800 mg/l)培養(yǎng)細(xì)胞。分別于12 h、24 h、48 h末用MTq、法(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)檢測內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活力，ELISA法測定培養(yǎng)液中內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物血管性假血友

5、病因子(Von willebrand factor，vWF)及硝酸還原酶法測定培養(yǎng)液中一氧化氮(nitric oxide，NO)的含量。 結(jié)果： 1.GPC作用12 h時(shí)，隨著GPC濃度增大，細(xì)胞增殖力逐漸增加，在濃度為200 mg/l時(shí)增殖作用最強(qiáng)，增殖率為162.47﹪。400mg/l和800mg/l濃度組的增殖率有所下降，但仍然顯著高于空白對照組。各濃度組的vWF生成量均小于空白對照組，差異有顯著性(P<0.01)

6、。各干預(yù)組的NO生成量也均較空白對照組增多，除10 mg/l組外，其余各組差異均有顯著性(P<0.01)。 2.作用24 h時(shí)，10mg/l～100mg/l濃度范圍內(nèi)的GPC對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性具有促進(jìn)作用，GPC濃度為100 mg/l時(shí)增殖活力最強(qiáng)，為1.39±0.03。10 mg/1～100 mg/l亞組vWF生成量較空白對照組明顯降低，而200mg/l～800mg/l亞組vWF量增加。100 mg/lGPC組NO生成量達(dá)

7、到最大量，200 mg/l、400 mg/l組隨著GPC濃度的增大N0逐漸減少，但仍高于空白對照組，800 mg/l組NO量低于空白對照組，差別無顯著性(P>0.05)。 3.作用48h時(shí)，GPC為10 mg/l時(shí)細(xì)胞生存活力為1.38±0.03，以后隨著GPC濃度增加存活力逐漸降低。10 mg/l組vWF含量低于空白對照組，而50 mg/l～800mg/l五組培養(yǎng)液中vWF含量均較空白對照組明顯增多。NO生成量在10 mg/

8、l組為40.24±4.54，以后隨著GPC濃度的增大，NO量逐漸減少，均低于空白對照組(p<0.05)。 結(jié)論：GPC在一定濃度范圍、一定作用時(shí)間內(nèi)可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖；高濃度的GPC抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長，對內(nèi)皮細(xì)胞有損傷作用，使內(nèi)皮細(xì)胞NO生成減少。 第二部分葡萄籽原花青素對糖基化損傷內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用及其可能分子學(xué)機(jī)制 背景：糖尿病是一種慢性終身性疾病，并累及多數(shù)臟器，已成為僅次于腦血管和腫瘤之后的第三位常見病、

9、多發(fā)病。隨著對糖尿病研究的不斷深入，人們已逐漸認(rèn)識到糖尿病的本質(zhì)是血管病變。1999年，美國心臟學(xué)會提出，糖尿病是一種心血管疾病。目前，大血管病變是糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病死亡的病因，占第1位的是AS為主體的病變。糖尿病患者的AS的發(fā)生率是非糖尿病患者的2-3倍。與非糖尿病患者相比，糖尿病患者的動(dòng)脈硬化發(fā)病較早、發(fā)展較快、病情較重、病死率高。糖尿病高血糖狀態(tài)下，體內(nèi)蛋白質(zhì)非酶糖基化通路被激活，產(chǎn)生的大量糖基化終產(chǎn)物(advaTa

10、ced glycatiOn end prodtJcts，AGEs)可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生紊亂，進(jìn)而引起許多病理生理學(xué)改變。AGEs可以通過與特異性受體一糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for advarreed glycation end prodtlcts，RAGE)相互作用形成AGE-RAGE系統(tǒng)在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。原花青素(19roanthocyanidin或procyanidin

11、，PC)是植物中廣泛存在的具有抗氧化作用的一大類多酚化合物的總稱，屬于生物類黃酮大家族中的一員。在美國1995年末的自由投票選舉中，原花青素被認(rèn)為是最受美國公眾青睞、并風(fēng)靡美國草藥市場的植物藥。四十多年來人們對從眾多不同植物中提取出的PC進(jìn)行了大量的研究。其中又因葡萄籽中原花青素(GPC)的含量極高而得到了最為深入和廣泛的關(guān)注。血管內(nèi)皮損傷、功能障礙是AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。因此，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞是防治糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。我們已證

12、實(shí)GPC能夠抑制糖尿病大鼠體內(nèi)非酶糖基化反應(yīng)，減少腎皮質(zhì)AGEs。但GPC對糖基化損傷內(nèi)皮細(xì)胞是否有保護(hù)作用，國內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。本研究采用體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞方法，測定細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞損傷標(biāo)志物vWF生成量及RAGE、PPAR γ蛋白表達(dá)情況，了解GPC對AGEs損傷內(nèi)皮細(xì)胞的作用，探討其可能的分子學(xué)機(jī)制。目的：不同濃度葡萄籽原花青素(GPC)和糖基化終產(chǎn)物(advanced glycationend prodtJcts，AGE

13、s)同時(shí)作用HLJVEC，觀察(1)MTT法檢測HUVEC增殖活力；(2)ELISA法測定培養(yǎng)液中vWF的生成量，研究GPC對HLJVEC糖基化損傷的保護(hù)作用；(3)western blot法檢測內(nèi)皮細(xì)胞糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advancedglycation end products，RAGE)的表達(dá)；(4)western blot法檢測過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators

14、-activated receptor γ，PPAR γ)蛋白表達(dá)水平。 方法：體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，糖孵育法制備糖基化終產(chǎn)物修飾牛血清白蛋白(AGEs-BSA)。實(shí)驗(yàn)分為六組：①正常對照組(control)：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；②試驗(yàn)對照組(BSA組)：200mg/l BSA培養(yǎng)24h：③AGEs組：200mg/l AGEs作用24h；④GPC(低劑量) +AGEs組：10mg/l GPC預(yù)處理細(xì)胞4h

15、后，加入200mg/lAGEs培養(yǎng)24h；⑤GPC(中劑量)+AGEs組：50mg/l GPC預(yù)處理細(xì)胞4h后，加入200mg/lAGEs培養(yǎng)24h；⑥GPC(高劑量)+AGEs組：10mg/1 GPC預(yù)處理細(xì)胞4h后，加入200mg/1 AGEs培養(yǎng)24h。采用MTT比色法檢測細(xì)胞生存活力：ELISA法測定培養(yǎng)液中vWF：western blot法檢測內(nèi)皮細(xì)胞糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advancedglycatio

16、n end products，RAGE)和過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferators—activated receptor γ，PPAR γ)蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：AGEs抑制HUVEC生存活力，細(xì)胞增殖活力下降為正常組的90.53﹪，不同濃度GPC預(yù)處理組的細(xì)胞生存活力逐漸增加，分別為正常組的0.95倍，1.12倍，1.23倍：AGEs組的vWF生成量較正常對照組明顯增加(p<0.01)，GPC