偽狂犬病病毒gE-TK基因缺失突變株的構(gòu)建.pdf

1、偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PrV)引起的家畜和多種野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)疾病為特征的急性傳染病,妊娠母豬可發(fā)生死胎和流產(chǎn),是危害養(yǎng)豬業(yè)的一個(gè)重要傳染病.PrV作為一種皰疹病毒,擁有龐大的基因組和許多非必需區(qū),具有用作表達(dá)外源基因的巨大潛力,被認(rèn)為是理想的活疫苗載體.PrV的胸苷激酶(TK)基因是PrV體外生長(zhǎng)和復(fù)制的非必需基因,卻是病毒神經(jīng)毒力的必需成分.通過(guò)誘變或基因工程技術(shù)使

2、TK基因滅活后,病毒的毒力顯著降低,但其免疫原性沒有改變,因此TK基因是外源基因的理想插入?yún)^(qū)之一.該研究以呈gE-表型的經(jīng)典弱毒疫苗Bartha-K61株為親本株,在通用PrV轉(zhuǎn)移載體pBdTK-Uni的基礎(chǔ)上,在其多克隆位點(diǎn)中插入由SV40早期啟動(dòng)子控制下的LacZ基因表達(dá)盒,同時(shí)將下游同源臂增加了一個(gè)1.7kb的KpnI片段,使上下游同源臂的長(zhǎng)度都超過(guò)了1kb,構(gòu)建了一個(gè)新的轉(zhuǎn)移載體pUni-LacZ.該載體與具有高度感染性的Bar

3、tha-K61株基因組DNA通過(guò)脂質(zhì)體加PLUS法共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,采用甲基纖維素固定病變,X-gal染色,經(jīng)過(guò)10代藍(lán)斑純化獲得了一株穩(wěn)定表達(dá)LacZ基因的gE/TK基因缺失突變株,命名為rPrV-LacZ.通過(guò)在LacZ基因表達(dá)盒內(nèi)部設(shè)計(jì)的一對(duì)擴(kuò)增430bp特異序列引物,對(duì)重組病毒每代進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果每代都能擴(kuò)增到該片段,說(shuō)明外源基因在PrV中的遺傳性狀十分穩(wěn)定.在不同的細(xì)胞上(PK-15、IBRS2、Vero和CEF)對(duì)重組病毒的