畢業(yè)設計論文微核形成與細胞周期關系的初步研究

1、<p>　　微核形成與細胞周期關系的初步研究</p><p>　　摘要：微核是真核生物細胞中的一種異常結構,他是各種理化因子，如輻射、化學藥物對分裂細胞作用的結果。一般認為微核是起源于落后染色體與喪失著絲粒的斷片，在有絲分裂末期形成。但是另一些實驗則表明間期細胞也可形成微核。本課題通過體外培養(yǎng)人的外周血淋巴細胞，在細胞周期的特定時期注射環(huán)磷酰胺20ug/ml，觀察淋巴細胞微核形成與細胞周期的關系;實驗結

2、果證實了細胞周期的各時期都可能有微核形成。</p><p>　　關鍵詞：環(huán)磷酰胺；淋巴細胞；細胞周期; 微核</p><p>　　Abstract:Micronucleus are the abnormal structure, which usually are the result of all kinds of physical-chemically factors such as

3、radiation，chemical medicine to mitotic cells. Micronucleus is generally believed that behind the origin and loss of centromere chromosome fragment, formed in late mitosis. However, while some other experiments on cells t

4、hat can form between the micronucleus.. This topic through in vitro of peripheral blood lymphocyte, In the cell cycle of specific period 20ug/ml cycl</p><p>　　Key Words: Cyclophosphamide; Lymphocytes; Cell c

5、ycle ；Micronucleus.</p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　摘要………………………………………………………………………………4</p><p>　　關鍵詞…………………………………………………………………………4</p><p>　　Abstract…………………………………

6、………………………………………4</p><p>　　Key words………………………………………………………………………5</p><p>　　1. 選題背景……………………………………………………………………5</p><p>　　1.1 課題來源…………………………………………………………………………5</p><p>　　1.

7、2 國內外的相關研究……………………………………………………………5</p><p>　　1.3 目的和意義………………………………………………………………………8</p><p>　　1.4 課題設計指導思想……………………………………………………………8</p><p>　　2. 方案論證……………………………………………………………………8</p&g

8、t;<p>　　2.1方案的設計原理………………………………………………8</p><p>　　2.2 方案論證……………………………………………………9</p><p>　　3. 材料與方法…………………………………………………………………10</p><p>　　3.1 材料與儀器……………………………………………………………………10</

9、p><p>　　3.2 實驗步驟…………………………………………………………………………11</p><p>　　4. 結果與討論…………………………………………………………………14</p><p>　　4.1 實驗結果…………………………………………………………………………14</p><p>　　4.2 結果與分析………………………………

10、……………………………………17</p><p>　　5. 結論與心得…………………………………………………………………17</p><p>　　5.1 結論………………………………………………………………………………17</p><p>　　5.2 心得………………………………………………………………………………17</p><p>　　

11、參考文獻………………………………………………………………………20</p><p><b>　　選題背景</b></p><p><b>　　課題來源</b></p><p>　　生命科學學院 王洪振老師</p><p><b>　　國內外的相關研究</b></p>

12、;<p>　　1.2.1微核的研究狀況</p><p>　　微核是指位于細胞漿中獨立于主核的核小體，其染色同主核，但比主核淡，其直徑小于主核1／3，主要由外界損害因素(生物、物理、化學)作用細胞后，導致細胞染色體丟失或斷裂，從而在胞漿中形成1個或數個小核[1]。因此，微核試驗在對外來化合物(如藥品、食品添加劑、農藥、化妝品、環(huán)境污染物等)遺傳毒性和職業(yè)暴露人群遺傳損害監(jiān)測和現場生態(tài)環(huán)境檢測方面，在診

13、斷和預防肝癌、食管癌、肺癌等惡性腫瘤方面得到了大量的應用。微核試驗最大的優(yōu)點是經濟、簡單、快速，而國內外大量的對比試驗研究，比較一致的看法是該方法在敏感性、特異性和準確性方面，與經典的染色體畸變分析方法基本相當[2]。因而，特別適合作為大量化合物和現場人群初篩的實驗方法。</p><p>　　微核試驗創(chuàng)建于20世紀70年代中期(1973～1975)[3,4]，目前許多國家和國際組織，已將其規(guī)定為新藥、食品添加劑、

14、農藥、化妝品等毒理安全性評價的必做實驗[5~8]。近年來，隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展和滲透到微核研究中，大大拓展了微核試驗的檢測和應用范圍，已發(fā)展成為能同時檢測染色體斷裂、丟失、分裂延遲、分裂不平衡、基因擴增、不分離、DNA 損傷修復障礙、Hprt基因突變、凋亡、細胞分裂不平衡等多種遺傳學終點的檢測，因而近年來國際上有人提出了新微核試驗概念[9]，從而大大拓展了微核試驗的應用范圍[10,11]。當然，要實現一個實驗多個遺傳損害終點的檢

15、測，需要更多的新的技術手段配合，如FISH技術、圖象分析技術等等，這也對我國的實驗室條件和研究水平提出了更高的要求。</p><p>　　由于大量新的化合物的合成，原子能應用，各種各樣工業(yè)廢物的排出，使人們很需要有一套高度靈敏，技術簡單的測試系統(tǒng)來監(jiān)視環(huán)境的變化。只有真核類的測試系統(tǒng)更能直接推測誘變物質對人類或其它高等生物的遺傳危害，在這方面，微核測試是一種比較理想的方法。目前國內外不少部門已把微核測試用于輻射損

16、傷、輻射防護、化學誘變劑、新藥試驗、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。微核試驗已成為檢測藥物、放射線、有毒物質的遺傳毒性，反映其對人體細胞或體外培養(yǎng)細胞遺傳學損傷的一個重要方法。近幾年，隨著DNA碎片的分析、細胞凋亡的研究、單克隆抗體的應用、人類基因組學研究和腫瘤基因組解剖計劃進一步豐富了微核理論。</p><p>　　1.2.2 微核形成的機理</p><p>　　微核形成的機理微核

17、形成的機理，多數學者認為微核主要來源于染色體畸變中的無著絲粒斷片和單條或多條染色體。曹佳等采用電鏡、BrdU標記、DNA探針雜交等技術[12~14]，對微核結構、功能進行了較系統(tǒng)的研究，發(fā)現部分淋巴細胞微核具有一定的結構和功能，部分微核具有DNA復制能力，不同誘變劑誘導的微核具有不同的染色體組成，并有一定的規(guī)律性。如非整倍體斷裂劑(化學誘變劑)誘導的微核，主要由丟失的整條染色體組成；染色體斷裂劑(物理因素)誘導的微核，主要由染色體斷片組

18、成。</p><p>　?、倩瘜W誘變學說：當細胞受到化學誘變劑作用后，造成染色體斷裂或有絲分裂器(主要指紡錘絲)的損傷，在細胞分裂后期，此斷片和染色體不能被納入子細胞核，形成游離在胞質中的小核(微核)。紡錘絲毒性類藥物如秋水仙堿、HO一221等直接抑制動物細胞紡錘絲的形成，阻止細胞分裂中期紡錘絲將染色體拉至細胞的兩端。Ando等n應用抗腫瘤藥(HO一221)抑制紡錘絲微管組裝，破壞紡錘絲，結果在染色體分析時誘導出

19、多倍體和亞二倍體細胞，未見染色體斷裂，鼠體內細胞也常被誘導出較大的微核。有機苯能引起微核增多且有明顯的致癌作用，苯三酚(1，2，4一苯三酚，BT)在氧化成醌時產生活性氧損傷DNA 和其它一些細胞大分子，實驗中BT能使淋巴細胞微核率上升2倍，使HK一60細胞微核率上升8倍，且總微核數兩類細胞呈劑量相關性增高，BT不僅引起染色體數目和結構的變化，而且通過產生新氧間接引發(fā)點突變。此外，我們用不同濃度的重金屬砷、鉛、錳、汞溶液對人外周血淋巴細胞

20、染毒試驗，發(fā)現微核在一定濃度范圍內呈顯著升高趨勢；通過對電焊工、油漆工、汽車司機、煉油廠職工這些有害因素接觸人群微核的檢測，我們也發(fā)現其微核率明顯高于健康對照組；我們通過</p><p>　?、诩毎M成成分缺乏學說：有作者對9位健康志愿者進行了葉酸限量試驗，從基礎用量的195 mg／d，減少到56 mg／d，維持5 w，然后慢慢補充葉酸，減量后的雙核淋巴細胞和全系淋巴細胞內的微核頻率均增高，且著絲點陽性和陰性的微

21、核都增加。當葉酸補充后，兩類細胞微核率明顯下降，著絲點陽性微核變化更為顯著。實驗表明，低葉酸血癥在臨床貧血癥狀之前，就出現了血液和口腔黏膜細胞遺傳物質損傷口引。可見其二者之間呈負相關，而血漿半胱氨酸濃度與微核率呈正相關，低維生素D導致血液細胞遺傳物質損傷[15]，微核率升高。由此可見，DNA合成過程所需原料的缺乏(關鍵酶、核苷酸以及膜完整性所需成分等)均可導致微核升高。</p><p>　?、廴旧w畸變斷片學說：

22、主要指電離輻射(包括X，中子，a)，體內外細胞受照射后，導致遺傳物質損傷，可誘發(fā)微核形成，由此可見這也是微核形成的一個重要因素[16，17]。研究資料表明，電離輻射誘發(fā)的微核主要是斷片形成的，其原因是電離粒子穿透染色體或其附近時，是染色體分子電離發(fā)生化學變化而斷裂形成斷片，最終形成微核，主要是有氧增強自由基增多所致。微核又是細胞凋亡產物，當程序性死亡基因被激活，隨之Ca 依賴性內切酶激活切割DNA，形成細胞核碎片，形態(tài)學表現為核深染，染

23、色質邊緣分布的帽形核，最后導致無數微核。經過我們多年對放射工作者、核生產廠礦及核爆試驗人員外周血淋巴細胞微核觀察，發(fā)現放射工作人員淋巴細胞微核細胞率、微核陽性檢出率均顯著高于正常健康對照組，受意外照射人員微核明顯增高，淋巴細胞微核細胞率、微核陽性檢出率與放射工齡呈陸線正相關關系，與個人年受照射劑量呈直線正相關，與個人累積受照劑量直線正相關。</p><p>　?、苣p傷學說：有的學者認為，輻射作用于核膜的某一部位

24、，使之變薄、穿孔，由于張力的作用，使核內容物從受損膜部位向外突出、延伸、收縊，最終連絲斷裂而形成微核。國際上普遍認為微核來源于染色體斷片或丟失的整條染色體，根據這一理論，細胞必須經過分裂后，才能觀察到微核。但國內薛開先采用放射自顯影、間期細胞及各周期微核定量分析等手段，于1986年首先提出了間期細胞可以以核芽突方式形成微核學說。曹佳使用BrdU標記和電鏡技術，也證實了這一途徑可以解釋部分微核的形成[13,18,19]。兩學者的工作同時認

25、為：這一途徑與染色體斷片和染色體丟失形成微核理論并不矛盾，都是遺傳物質的丟失，具有相同的遺傳毒理效應。根據這一新的論點，在人群監(jiān)測中采集的外周血不需培養(yǎng)，即可直接在外周血淋巴細胞中觀察到微核的存在。</p><p>　　⑤基因突變學說：這里主要指病毒感染，可引起基因突變，蛋白質和酶的變化，從而影響DNA的復制，誘發(fā)染色體畸變形成微核。DNA損傷和修復在機體維持動態(tài)的平衡，通過研究自發(fā)微核率與性別、年齡的關系，我們

26、發(fā)現人體微核呈偏態(tài)分布，說明細胞存在自發(fā)突變，微核隨年齡增加，不受性別影響，此外，逆轉錄現象的發(fā)現和核酶的研究，加深了我們對中心法則的認識，拓寬了RNA病毒致癌、致病的研究。病毒癌基因、細胞癌基因和癌基因活化機制，以及細胞凋亡機制的深入研究，也是對此學說的有力證明。無論何種學說，都認為微核是核物質，并有DNA合成能力。</p><p>　　當細胞微核作為一種評價指標用于輻射損傷、藥物篩選、腫瘤防治的實驗研究, 使

27、它形成“微核測定法”被肯定以來, 人們就越來越關心和重視細胞微核在各種因素作用下形成機理的探討。</p><p><b>　　目的和意義</b></p><p>　　微核實驗從建立開始就因為其靈敏、穩(wěn)定，且能檢測染色體完整性改變和染色體分離改變兩種遺傳學終點而得到廣泛應用，隨分子生物學技術的發(fā)展，現已成為可檢測多終點的分子毒理學方法。在非整倍體毒劑檢測、致突變物篩選和

28、外來化合物生物毒作用機制研究等領域有廣閼的應用前景。誠然，目前微核實驗還存在：用于檢測微核著絲粒和端粒的DNA探針的特異性和靈敏性不十分滿意、尚不能全面分析微核來源于哪條染色體、微核自動化分析費用高等局限性；然而，隨新DNA探針的不斷發(fā)現、多色熒光原位雜交和計算機輔助的激光共焦顯微分析技術的發(fā)展，通過微核實驗能更細致、快捷地檢測微核的染色體來源。評價外來化臺物的毒性作用。</p><p>　　微核試驗已成為檢測藥

29、物、放射線、有毒物質的遺傳毒性，反映其對人體細胞或體外培養(yǎng)細胞遺傳學損傷的一個重要方法。近幾年，隨著DNA碎片的分析、細胞凋亡的研究、單克隆抗體的應用、人類基因組學研究和腫瘤基因組解剖計劃進一步豐富了微核理論，但研究范圍仍局限于幼紅細胞、成熟淋巴細胞及體外細胞株。隨著微核試驗檢測范圍的進一步拓寬，新微核試驗正向我們走來，我國學者應加強對這一方法的研究，加大新技術示范與推廣的力度，以縮小與國際同行研究的距離。</p><

30、;p>　　1.4 課題設計指導思想</p><p>　　本試驗的目的是為了掌握微核試驗的基本原理和基本技能，通過研究環(huán)磷酰胺誘導人的外周血淋巴微核形成，判斷微核在細胞周期的哪個時期形成或哪個時期微核率（MNF）最大。</p><p><b>　　2 方案論證</b></p><p>　　2.1 方案的設計原理</p>

31、<p>　　本試驗選取人的外周血淋巴細胞作為試驗對象，觀察環(huán)磷酰胺對其影響以及微核的產生，判斷微核在細胞周期的哪個時期形成或哪個時期微核率（MNF）最大，以及微核的一些性質研究。</p><p><b>　　2.2 方案論證</b></p><p>　　2.2.1 實驗對象的選擇</p><p>　　微核實驗的研究對象已從骨髓紅細胞擴

32、展到多種在體細胞和離體培養(yǎng)細胞。過去認為紅細胞成熟過程中能把主核排出胞外．微核滯留在胞內，易于識別，而外周血中的含微核紅細胞又常被脾臟清除，所以常規(guī)微核實驗以小鼠骨髓嗜多染紅細胞為研究對象。80年代后發(fā)現小鼠脾臟不能有效清除含微核紅細胞．小鼠外周血紅細胞微核實驗結果與骨髓嗜多染紅細胞微核實驗有較好的一致性。顯然前者更簡便。并可對同一動物進行多次采樣分析。目前，該方法已被國際組織普遍接受，日本學者還直接分離小鼠血中微核進行有關微核染色體組

33、成的研究[23]。最近還發(fā)現紅細胞也可把微核排出胞外。并且被排出的微核主要來源于整條染色體[24]。</p><p>　　隨技術發(fā)展，已能有效識別有核細胞中的微核。人外周血淋巴細胞、實體組織活檢細胞、組織脫落細胞(口腔、泌尿道)微核率等能在一定程度上反映射線及外來化合物等對某些器官造成的遺傳毒性損害，對腫瘤的研究、診斷均有較大參考價值，許多研究把它們作為生物劑量監(jiān)測指標。生殖細胞(主要是精子)微核率，由于其特殊的

34、遺傳地位，亦有較多研究報道。</p><p>　　培養(yǎng)細胞微核實驗避免了個體差異因素的影響，易于控制實驗條件，操作簡便。體外培養(yǎng)的血淋巴細胞、各種哺乳動物細胞系、原代腫瘤細胞、肝細胞及蠶豆根尖、紫露草等植物細胞等已廣泛用于微核實驗研究?？傊筛鶕嶒炐枰x擇合適的細胞進行微核實驗研究。</p><p>　　2.2.2 實驗研究的方法</p><p>　　①細胞動力

35、學阻滯微核分析:1985年Feneeh等建立了該方法，用胞質分裂阻滯劑阻斷胞質分裂，但不影響胞核分裂，有絲分裂細胞呈特殊形態(tài)的雙核細胞，未發(fā)生核分裂的細胞則維持單核細胞形態(tài)。檢測致突變固索作用后的雙核細胞率和雙核細胞做核率，可同時獲得致突變因素對細胞的遺傳毒性損害和對細胞周期影響的信息。這一方法倍受青睞．迅速得到廣泛應用，不僅與后面提及的免疫熒光和原位雜交技術配合運用，可以準確分辨微核來源，判斷姐妹染色單體在子代細胞的分市。而且，通過觀

36、察雙核細胞的兩個子代核間是否有染色質橋，可檢測染色體分離障礙；用阿糖胞苷抑制DNA切除修復，觀察雙核細胞微核率的變化，可檢測DNA雙鏈損傷情況及DNA切除修復缺陷；觀察含6一琉基嘌呤的培養(yǎng)基中生長的雙核和多核細胞率．可以檢測HPRT基因突變情況[25]。</p><p>　?、诿庖邿晒馕⒑朔治?硬皮病患者血清中含有抗著絲粒(antikinetochore antibodies)，能特異性地與人和一些哺乳動物的著絲

37、粒蛋白結合，通過免疫熒光技術檢測微核中是否存在著絲粒蛋白，可初步判斷微核來自于整條染色體還是染色體斷片。由于硬皮病患者常有明顯的CREST征(即鈣質沉著、雷諾現象、食管能動性障礙和指、趾硬皮病等)，這種方法也稱CREST染色。1986年Vig[26] 等首先報道了這一方法，其后很多研究采用了這種方法，我們也用這種方法分析了昆明山海棠和丙烯酰胺誘導的微核[27,28]。由于這種方法檢測的是著絲粒蛋白，如果化合物能使著絲粒蛋白失活或合成受抑

38、，就會導致假陰性結果。已有研究表明．絲裂霉素c(mitomyein c)、5一氮胞嘧啶(5一azacyti—dine)、地西泮(diazepam)、甲胺嘧啶(pyrimethamine)和氫釀(hydroq~none)等均可通過上述途徑導致著絲粒陽性微核率下降。然而，這種方法簡便易行，當受試化合物對著絲粒蛋白無影響時，還是相當準確可靠，所以受到不少學者推崇。</p><p>　?、蹮晒庠浑s交微核分析:用著絲粒D

39、NA探針或同時應用著絲粒和端粒DNA探針，通過熒光原位雜交，檢測做核著絲粒和端粒信號，可準確判斷微核來源于整條染色體還是染色體斷片，推測微核所含染色體和斷片的數目。應用染色體特異性DNA探針，可檢測姐妹染色單體在于代細胞的分布(包括染色體丟失和染色體不分離)，分辨微核內是否含有某幾條染色體。從而深入分析誘導微核形成的理化因素的遺傳毒性及毒作用靶位等。</p><p>　?、茉粏覦NA合成微核分析:用寡核苷酸引

40、物，通過少數幾輪PCR原位擴增目的DNA序列。并摻入地高辛標記的dUTP，如熒光原位雜交一樣地度微核內的著絲粒或端粒呈現熒光信號。Russo等用這種方法檢測了絲裂霉素C和秋水仙素誘導的小鼠脾細胞著絲粒和端粒組成，認為這種方法靈敏度高，重復性好．并且更快捷。</p><p>　?、輰ξ⒑思毎M行凋亡檢測:凋亡是一種由遺傳調控的細胞生理性死亡機制，由于一些癌基因和抑癌基因參與了凋亡的調控，引起了人們的廣泛關注。尤其是

41、P53基因，它既參與了DNA損傷所致的細胞周期阻滯和凋亡，也是維持基</p><p>　　因組穩(wěn)定性所必需。有研究認為P53還與微核形成有關。細胞遺傳物質受損傷可能出現：仍能正常分裂、微核和非整倍體形成、發(fā)生凋亡?？梢?，凋亡也是遺傳毒性損傷后續(xù)效應的一個重要指標，評估化合物遺傳作用時，進行細胞凋亡率檢測有重要意義。</p><p><b>　　3 材料與方法</b>&

42、lt;/p><p><b>　　3.1 材料與儀器</b></p><p>　　3.1.1 藥物與試劑</p><p>　　環(huán)磷酰胺粉末（針劑），生理鹽水，0.5％KCl溶液，蒸餾水，甲醇，冰醋酸，Giemsa原液，1mg/ml Brdu，PHA粉末（針劑），1 ug/ml秋水仙素，滅活小牛血清。</p><p>　　3.1

43、.2 儀器與設備</p><p>　　試劑瓶，燒杯，量筒，玻璃棒，注射器，滴管，10ml離心管，鑷子，酒精燈，手套，口罩，離心機，電子天枰，光學顯微鏡，37℃培養(yǎng)箱，超凈臺，酒精燈，移液搶，冰箱, 試管架 ，定時鐘，脫脂玻片，火柴等</p><p><b>　　3.2 實驗步驟</b></p><p>　　3.2.1 溶液的配置</p&g

44、t;<p><b>　　一．常規(guī)溶液</b></p><p>　　(一)1/15mol/L PBS(磷酸緩沖液Phosphate Buffer Solution，PBS)</p><p>　　甲液：1/15mol/L Na2HPO4溶液</p><p>　　Na2HPO4 9.465g<

45、/p><p>　　蒸餾水 加至1000ml</p><p>　　乙液：l/15mol/L KH2PO4溶液</p><p>　　KH2P04 9.07g</p><p>　　蒸餾水 加至1000m1</p><p

46、>　　分裝在棕色瓶內，于4℃冰箱中保存，用時甲、乙兩液各按不同比例混合，即可得所需pH的緩沖液,見下表:</p><p>　　(二)10μg／ml秋水仙素</p><p>　　秋水仙素 lOmg</p><p>　　生理鹽水 100ml</p><p>　　裝入

47、茶色瓶中，為貯備液，4℃冰箱中保存。甩時取貯備液1ml加生理鹽水9ml即可。</p><p>　　(三)Giemsa染液</p><p><b>　　1．貯備液</b></p><p>　　Giemsa粉 1g</p><p>　　純甘油

48、66ml</p><p>　　甲醇 66ml</p><p>　　先將Giemsa粉置于研缽中加少量甘油，充分研磨，呈無顆粒的糊狀。再將全部甘油加入，放入56℃溫箱中2小時，然后加入甲醇，保存于茶色瓶中。一般兩周后使用為好。</p><p><b>　　2．工作液</b></p>&

49、lt;p>　　臨用時將貯備液與pH6.8的磷酸鹽緩沖液按照1:20混合。</p><p><b>　　二、細胞培養(yǎng)液</b></p><p>　　(一)0.01mol／LPBS(磷酸鹽緩沖液Phosphate Buffer Saline，PBS)pH7.2。</p><p>　　0.2mol／L磷酸氫二鈉液(甲液)： </p>

50、;<p>　　NaH2PO4·12H2O 35.814g</p><p>　　雙蒸水 加至500ml</p><p>　　0.2mol／L磷酸二氫鈉液(乙液):</p><p>　　NaH2PO4·12H2O

51、 15.601g</p><p>　　雙蒸水 加至500ml</p><p>　　取甲液36ml，乙液14ml和NaCl8.2克，加雙蒸水至1000ml?；靹虼耆芙夥盅b，經高壓滅菌后保存于4℃冰箱備用。</p><p><b>　　(二)Hanks液</b><

52、;/p><p><b>　　1．原液甲</b></p><p>　　NaCl 160g</p><p>　　KCl 8g</p><p>　　MgSO4·7H2O

53、 2g</p><p>　　MgCI2·6H2O 2g</p><p>　　溶于800ml餾水中。</p><p>　　CaCl2(無水) 2.8g</p><p>　　溶于100ml蒸餾水中。<

54、/p><p>　　將兩種液體混合后，加水至1000ml用濾紙濾過，再加2ml氯仿防腐，置4℃冰箱備用。</p><p><b>　　原液乙</b></p><p>　　Na2HPO4·12H2O 3.04g</p><p>　　KH2PO4

55、 1.2g</p><p>　　葡萄糖 20.0g</p><p>　　溶于800ml蒸餾水中，用濾紙過濾，然后加0.5％酚紅80ml，再加水至1000ml，最后加入2ml氯仿防腐，置4℃冰箱備用。</p><p>　　(三)1640培養(yǎng)液(含lO％小牛血清)</

56、p><p>　　RPMI-1640粉 10.39g</p><p>　　雙蒸水 加至1000ml</p><p>　　通入適量的C02氣體，邊通入CO2邊慢慢攪拌，使其(呈透明)完全溶解。用NaHCO31.5克調pH值到7.2。</p>&l

57、t;p>　　雙抗100u/ml 10ml</p><p>　　滅活小牛血清 110ml</p><p>　　混勻上述液體，立即用G6抽濾除菌分裝，置4℃冰箱備用。</p><p>　　(四)BrdU溶液(200ug/m1)</p><p

58、>　　用無菌青霉素瓶，在室溫下稱取1.0mg，在無菌條件下加入滅菌生理鹽水9.0ml，溶解，混勻，用黑紙包嚴，避光置冰箱冰格中保存。最好用時現配。</p><p><b>　　（五）環(huán)磷酰胺溶液</b></p><p>　　從冰箱中取一只注射用環(huán)磷酰胺粉末（劑量為0.02g），用20ml的超凈水溶解，使得環(huán)磷酰胺濃度為10mg/ml。由于使用時的濃度為1mg/m

59、l，因此使用時稀釋10倍即為成為配制成1mg/ml環(huán)磷酰胺溶液。</p><p><b>　?。┲破潭ㄒ?lt;/b></p><p>　　甲醇：冰醋酸(3：1)混合液，現配先用。</p><p>　?。ㄆ撸┩庵苎馨图毎囵B(yǎng)液的配置</p><p>　　將兩瓶肝素40ml,每瓶加10ml小牛血清，配置成20%的小牛血瓶

60、培養(yǎng)液，封口，放入4℃冰箱儲存</p><p>　　3.2.2 取血及外周血淋巴細胞的培養(yǎng) </p><p>　　抽取健康男性的靜脈血各5ml,分別加入到3個培養(yǎng)瓶（裝有50 ml 20%的小牛血瓶培養(yǎng)液），血液加入培養(yǎng)液后搖勻（不能太劇烈）分裝。因此每個時期有三組。</p><p>　　1、G0期：分裝8ml加血液的培養(yǎng)液，不加PHA，接種后立刻加入1mg/ml環(huán)

61、磷酰胺0.2ml，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h收獲。</p><p>　　2、在剩下的血液培養(yǎng)液中加入一支PHA（先用2ml超凈水溶解）。</p><p>　　①、G1期：分裝10ml加血液的培養(yǎng)液，立刻加入1mg/ml環(huán)磷酰胺 0.2ml在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22h收獲。</p><p>　?、?、S.G2期：分裝20ml加血液的培養(yǎng)液接種后在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4

62、8h收獲。其中培養(yǎng)20h-24h后，加入1mg/ml環(huán)磷酰胺 0.4ml;收獲前 2.5-3h，加入1 ug/ml秋水仙素1.05ml;收獲前30min，加入1mg/ml Brdu 0.33ml。</p><p>　　③、M期：分裝10ml加血液的培養(yǎng)液接種后在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46h，加入1mg/ml環(huán)磷酰胺0.2ml，收獲前 2.5-3h，加入1 ug/ml秋水仙素0.53ml ,收獲前30min加入1mg/

63、ml Brdu 0.17ml。</p><p>　　3.2.3 外周血淋巴細胞微核制片</p><p>　　1、收集培養(yǎng)物：培養(yǎng)時間滿時取出培養(yǎng)瓶，輕輕去掉瓶蓋，用帶帽滴管吸去每瓶上清液(1.0ml)，然后兩瓶平行標本合并移入l0ml離心管內。如培養(yǎng)物取出時已混，則兩瓶混勻后移入l0ml離心管中，與對照平衡后1500轉/分離心5分鐘，吸去上清留底液。</p><p>

64、;　　2、低滲：往已有2ml培養(yǎng)物離心管內加入0.5％KCl溶液8ml，混合后放37oC保溫低滲10分鐘。</p><p>　　3、預固定：低滲后加固定液0.5ml，混勻后1000轉/分離心5分鐘，用滴管去掉上清(要盡量把上清去凈，但不能丟失沉淀物)。</p><p>　　4、固定：將沉淀物輕輕混勻后，沿離心管壁加入固定液并迅速輕輕與沉淀物混合，有塊狀物要打散，然后加固定液至3～4ml，蓋

65、上蓋，放37℃保溫固定15分鐘。固定后以1000轉/分離心5分鐘，取出后去上消(要盡量把上清去凈，但不能丟失沉淀物)，如此反復再固定2次。</p><p>　　5、制片：第三次固定后去上清，留沉淀物0.2～0.4ml，混勻后用滴管吸取分別滴在己預冷的玻片左右各三分之一處，輕輕吹散，然后通過火焰固定，即為未染色標本，備用。</p><p><b>　　3.2.4 染色 </b

66、></p><p>　　本試驗采取Giemsa染色，待骨髓片自然晾干之后，用新鮮配制的PH7.4的磷酸鹽緩沖液的10%的Giemsa染液染色10~15min，染色完畢后用蒸餾水沖洗，自然晾干即可。</p><p>　　3.2.5 觀察結果</p><p>　　先以低倍鏡，選擇細胞分布均勻、疏密適度、形態(tài)完整、染色良好的區(qū)域，然后再在高倍鏡下對實驗結果進行拍照

67、。</p><p><b>　　4 結果與討論</b></p><p><b>　　4.1實驗結果</b></p><p>　　4.1.1環(huán)磷酰胺（誘導微核照片：</p><p>　　圖4-6 Go期 hp（1） 100ⅹ10 圖4-7 Go期 hp（2）

68、 100ⅹ10</p><p>　　圖4-1 G1期 hp（1） 100ⅹ10 圖4-2 G1 期hp（2） 100ⅹ10</p><p>　　圖4-3 微核增值期 hp（1） 100ⅹ10 圖4-4 S期 hp（2） 100ⅹ10</p><p>　　圖4-5 G2期 hp

69、 100ⅹ10</p><p>　　圖4-8 M期hp（1） 100ⅹ10 圖4-9 M期 hp（2） 100ⅹ10</p><p><b>　　4.1.2微核計數</b></p><p>　　4.1.3淋巴細胞細胞周期各時期的微核率</p><p><b>　　

70、4.2結果與分析</b></p><p><b>　　實驗結果表明: </b></p><p>　?、偌毎芷诟麟A段均可有不同程度的微核形成, 其中最多的是G1期, 其次是G2期，其他各時期均可能形成較少量的微核。</p><p>　?、赟期細胞的微核率較G1期有極顯著的下降,這提示大部分G1期的微核細胞不能進人S期, 使細胞增殖中

71、止, 這可能是抗癌藥物殺傷腫瘤細胞的機制之一。</p><p>　　③圖4-8M期微核照片一定程度上證明了微核起源于落后染色體與喪失著絲粒的斷片。</p><p><b>　　結論與心得</b></p><p><b>　　5.1結論</b></p><p>　　細胞周期的各個時期均可形成微核, 其

72、中微核最多的時期是G1期, 其次是G2期。 S期細胞的微核率較G1期有極顯著的下降,這表明大部分G1期的微核細胞不能進人S期, 使細胞增殖中止，這為預防治療癌癥腫瘤有很深遠的意義。</p><p><b>　　5.2心得</b></p><p>　　5.2.1 歸納總結</p><p>　　在制片的過程中，要將玻片事先放入冰箱，準備好冰片。制

73、片以滴片的方式進行，使用冰片是因為冰片的效果要好于普通玻片。</p><p>　　5.2.1.2 染色</p><p>　　本試驗采取Giemsa染色，在染色時應注意將染色液覆蓋滿整個玻片，使得染色過程進行得更為充分。同時也要在玻片下面墊上紙片，以免Giemsa染液對實驗臺造成污染。染色時間應該不低于15分鐘，用蒸餾水沖洗染液時，應該讓蒸餾水以細小的水流均勻的從玻片一端沖下，并且不能讓水

74、流直接接觸被染色的細胞，以免將細胞沖走。</p><p>　　5.2.2 尚存在的問題</p><p>　　經過了資料查找與總結，方案的提出與修改，以及實驗這幾個階段，最終得出了一些實驗的結果，但是在實驗過程中發(fā)現了許多的問題和大量有待于改進的地方。</p><p>　　5.2.2.1 染色方法的使用</p><p>　　進行微核試驗時，

75、一般會選擇Giemsa染色，feulgen染色以及吖啶橙熒光染色這三種染色方法。本試驗中采取的是簡單，易操作的Giemsa染色，雖然這種方法尤其突出的優(yōu)勢，但是也存在一些不足。一般來說，這種染色不能分辨細胞中的DNA、RNA以及其他的嗜堿性顆粒，因此容易產生假陽性現象，高估嗜多染紅細胞中微核產生的水平。由于試驗時間，實驗室條件等因素的限制，本試驗只采取了一種染色方法。希望在以后的試驗中，能夠采取幾種不同染色的方法同時進行觀察。例如可以將

76、Giemsa染色和吖啶橙熒光染色分別運用到同一試驗中，以便更準確的觀察試驗結果。</p><p>　　5.2.2.3 探究微核試驗中染色體損傷的機制</p><p>　　本試驗屬于傳統(tǒng)的微核試驗，只能觀察化學毒性物質對于淋巴細胞的遺傳毒性作用，無法鑒別毒性藥物是屬于非整倍體劑還是染色體斷裂劑。如果將免疫熒光技術引入這項傳統(tǒng)的微核試驗之中，突顯出染色體的著絲粒部分，則可以通過鑒別細胞中的微

77、核是由染色體斷片還是含著絲粒的染色體片段或一條甚至多條染色體組成，來鑒別化學毒性物質的種類。</p><p>　　希望在今后的試驗中引入熒光免疫技術，確定遺傳毒性物質的種類以及染色體受損傷的最主要的原因和機制。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 曹佳，林真，余爭平．微核試驗一原理、方法及其在人群監(jiān)測和毒性

78、評價中的應用[M]． </p><p>　　北京：軍事醫(yī)學科學出版社，2000：1—9．</p><p>　　[2] Heddle J A，Cimino M C，Hayashi M，et a1．Micronuclei as an index of cytogenetic damage：Past，Presentand Future[J]．Environ Mole Mutagen，1 991，

79、18：277— 291．</p><p>　　[3] Heddle J A．A rapid in vivo test for chromosomal damage[J]． Mutat Res，1973，18：l87一l 90．</p><p>　　[4] Schmid W．The micronucleus test[J]．Mutat Res，1 975，31：9— 15．</p>

80、;<p>　　[5] 歐洲經合組織化學物質毒性實驗指南．哺乳動物紅細胞微核試驗(1995)，見：曹佳主編．微核試驗[M]．北京：軍事醫(yī)學科學出版社，2000，264—272．</p><p>　　[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局．新藥(西藥)臨床研究指導原則匯編(毒理學)[M]．1993：216—217．</p><p>　　[7] Angela E，et a1．Mutag

81、enicity test schemes and guidelines：U ．S．EPA office of pollution prevention and toxics and office of pesticide programs[J]．Environ Mole Mutagen，1 993，21(1)：38— 45．</p><p>　　[8] Sofuni T．Japanese guidelines f

82、or mutagenicity testing[J]．Environ Mole Mutagen，1993，21(1)：2—7．</p><p>　　[9] Fenech M ．The advantanges and disadvantanges ofthe cytokinesisblock micronucleus method[J]．Mutat Res，1997，392(1～ 2)：11— 18．</p&