華支睪吸蟲(chóng)ATP合酶b亞基的定位與細(xì)胞周期的關(guān)系.pdf

1、華支睪吸蟲(chóng)病(clonorchiasis)又稱肝吸蟲(chóng)病，是由華支睪吸蟲(chóng)(Clonorchissinensis)感染引起的人獸共患寄生蟲(chóng)病。華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)寄生于人或其它終宿主的肝膽管內(nèi)，可對(duì)肝膽系統(tǒng)造成慢性損傷，引起膽管局限性擴(kuò)張、膽管上皮增生、膽管炎、肝硬化甚至誘發(fā)肝膽管腫瘤。全世界將近3500萬(wàn)人感染華支睪吸蟲(chóng)。我國(guó)目前感染人數(shù)為1249萬(wàn)，分布在除西北數(shù)個(gè)省區(qū)外的25個(gè)省，以廣東省感染率為最高。 華支睪吸蟲(chóng)作為復(fù)殖目吸蟲(chóng)的典

2、型代表，是一種比較好的模式生物。隨著模式生物基因組研究的展開(kāi)，研究者開(kāi)始通過(guò)對(duì)華支睪吸蟲(chóng)結(jié)構(gòu)基因組和功能基因組的研究來(lái)探討華支睪吸蟲(chóng)在復(fù)雜的生活史過(guò)程中其基因的表達(dá)調(diào)控、能量代謝以及與宿主之間相互作用的分子機(jī)制。華支睪吸蟲(chóng)寄生在膽管中，以厭氧代謝為主。其能量代謝的特點(diǎn)，尤其是線粒體在厭氧條件下ATP合酶的結(jié)構(gòu)和功能特征，值得深入研究。本研究主要通過(guò)對(duì)該基因的研究來(lái)了解華支睪吸蟲(chóng)ATP合酶的某些結(jié)構(gòu)和功能特征。 生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)

3、果顯示華支睪吸蟲(chóng)ATP合酶b亞基具有線粒體靶向序列和細(xì)胞核定位序列，這種截然不同的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室分布是否真實(shí)?調(diào)控該蛋白進(jìn)入線粒體和細(xì)胞核的因素是什么?對(duì)細(xì)胞的能量代謝有什么意義?為了澄清這些疑問(wèn)，闡明ATP合酶b亞基的亞細(xì)胞定位至關(guān)重要。蛋白的亞細(xì)胞定位，除了通常采用的免疫組化電鏡外，利用綠色熒光蛋白作為示蹤物，與目的基因在真核細(xì)胞中融合表達(dá)，也可模擬蟲(chóng)體內(nèi)蛋白的亞細(xì)胞定位。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)3種去除靶向序列的突變體基因與綠色熒光蛋白真核載體

4、pEGFP-N1在HeLa細(xì)胞融合表達(dá)，并對(duì)不同細(xì)胞周期融合蛋白的定位和表達(dá)水平進(jìn)行觀察和測(cè)定，探討華支睪吸蟲(chóng)ATP合酶b亞基的亞細(xì)胞定位和參與細(xì)胞能量代謝調(diào)控的方式。 本研究對(duì)于深入了解寄生蟲(chóng)細(xì)胞生物學(xué)和篩選可能的抗寄生蟲(chóng)藥物的新靶點(diǎn)有重要意義。 研究結(jié)果 1．CsATP-synt B基因的篩選和鑒定Blastx分析該基因?yàn)槿L(zhǎng)基因，屬于ATP合酶b亞基家族，其分子進(jìn)化樹(shù)與種系進(jìn)化過(guò)程非常吻合。該基因全長(zhǎng)100

5、8bp，其ORF含900bp，編碼300個(gè)氨基酸，其推導(dǎo)的氨基酸序列與人ATP-synt_B一致性達(dá)到41﹪，相似性達(dá)59﹪。Predictprotein預(yù)測(cè)該蛋白是一個(gè)膜蛋白，有兩個(gè)跨膜區(qū)(117-134、142-159)；α螺旋(H)、β折疊(E)和無(wú)規(guī)卷曲(L)的比例分別是68.67﹪：5.67﹪：25.67﹪，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋(H)為主。只有少數(shù)氨基酸殘基包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部，大部分氨基酸殘基暴露在溶液界面。Mitoprot分析其含

6、有線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)序列(1-29)，Motifscan分析其有核定位序列(染色體二深裂結(jié)合區(qū)，239-256)和多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，具有較穩(wěn)定的理化性質(zhì)。其編碼氨基酸理論分子量為34319.4，理論等電點(diǎn)9.04；去除線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)序列之后，編碼271個(gè)氨基酸，理論分子量為31131.7，理論等電點(diǎn)7.90。 2．CsATP-synt_B<'30-300>基因的原核克隆表達(dá)和重組蛋白的免疫組織定位設(shè)計(jì)引物從質(zhì)粒cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增CsATP-s

7、ynt_B<'30-300>，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA條帶在750bp與1000bp之間，測(cè)序確定為813bp，與篩選得到的CsATP-synt_B基因cDNA序列一致。定向克隆獲得的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-CsATP-synt_B<'30-300>經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定后證實(shí)構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在1mmol/L IPTG、28℃下誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE顯示與理論預(yù)測(cè)的融合蛋白分子量35781.0相符

8、。將純化的CsATP-synt_B<'30-300>免疫SD大鼠，獲得了大鼠抗CsATP-synt_B<'30-300>抗血清。重組蛋白免疫大鼠能產(chǎn)生高水平的抗體(ELISA效價(jià)達(dá)25,600)，表明其具有良好的免疫原性；通過(guò)Western-blotting方法，重組蛋白可被免疫血清所識(shí)別，表明含有線性表位，與生物信息學(xué)手段所做的表位分析和結(jié)構(gòu)分析相符。 經(jīng)過(guò)免疫組織定位，發(fā)現(xiàn)CsATP-synt_B<'30-300>蛋白在華支

9、睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)蟲(chóng)體的分布比較廣泛，幾乎遍布整個(gè)蟲(chóng)體，其中腹吸盤、卵巢、卵黃腺和體表的熒光比較強(qiáng)，說(shuō)明在這四個(gè)部位能量代謝比較旺盛。 3．CsATP-synt_B在Hela細(xì)胞中模擬蟲(chóng)體亞細(xì)胞定位與細(xì)胞周期的關(guān)系設(shè)計(jì)引物從華支睪吸蟲(chóng)cDNA文庫(kù)擴(kuò)增相應(yīng)的片段，克隆4個(gè)真核重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功。 將構(gòu)建好的真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察各重組質(zhì)粒的

10、表達(dá)，對(duì)照組pEGFP-N1在Hela細(xì)胞整個(gè)細(xì)胞都有表達(dá)，是均質(zhì)分布；對(duì)照組pEYFP-Mito是定向于線粒體的質(zhì)粒，它在細(xì)胞核中未見(jiàn)有黃色熒光；H<,2>B-CFP是定向于細(xì)胞核的質(zhì)粒，在細(xì)胞核中顯示青色熒光，在細(xì)胞質(zhì)中未見(jiàn)表達(dá)。pEGFP-N1-CsATP-synt_B<'1-300>細(xì)在Hela細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞核均有表達(dá)，同時(shí)在線粒體中表達(dá)的情況與pEYFP-Mito相符。與3個(gè)突變體的比較如下：pEGFP-N1-CsATP-

11、synt_B<'30-300>在胞漿中的表達(dá)與空載體pEGFP-N1相符都是均質(zhì)分布于整個(gè)Hela細(xì)胞，而有些細(xì)胞在細(xì)胞核中有表達(dá)，有些沒(méi)有，這可能與細(xì)胞周期不同時(shí)點(diǎn)有關(guān)；pEGFP-N1-CsATP-synt_B<'(1-238)+(257-300)在Hela細(xì)胞中的表達(dá)情況與載體pEYFP-Mito相似，在細(xì)胞核中少見(jiàn)有表達(dá)；而pEGFP-N1-CsATP-synt_B<'(30-238)+(257-300)的表達(dá)情況與與空載體pE

12、GFP-N1極其相似，整個(gè)細(xì)胞在鏡下發(fā)出綠色熒光。 對(duì)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CsATP-synt_B<'1-300>的Hela細(xì)胞進(jìn)行同步化處理，分析在不同的細(xì)胞周期該融合蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位的變化。經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，空載體pEGFP-N1在G<,0>/G<,1>期表達(dá)量明顯下降，而pEGFP-N1-CsATP-synt_B<'1-300>在這個(gè)時(shí)期表達(dá)量是呈上升的趨勢(shì)。其他細(xì)胞周期時(shí)相，熒光表達(dá)量的變化趨勢(shì)相似。倒置熒光顯微

13、鏡觀察發(fā)現(xiàn)融合蛋白在G<,1>期進(jìn)入細(xì)胞核，其它時(shí)期主要分布在線粒體。 在不同的細(xì)胞周期，通過(guò)對(duì)CsATP-synt_B<'1-300>和Hela細(xì)胞HomoATP-synt_BmRNA的表達(dá)進(jìn)行半定量RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)融合蛋白在G<,1>期進(jìn)入細(xì)胞核后，兩種基因的表達(dá)均成上升趨勢(shì)，說(shuō)明融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞核是受細(xì)胞周期的調(diào)控，并且對(duì)目的基因CsATP-synt_B<'1-300>的表達(dá)起活化作用。 研究結(jié)論 1

14、．通過(guò)華支睪吸蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的篩選結(jié)合生物信息學(xué)分析手段獲得CsATP-synt_B基因，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白不僅有常見(jiàn)的MTS，還有一段NLS BP，這是個(gè)比較罕見(jiàn)的現(xiàn)象。 2．成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體pET-28a(+)-CsATP-synt_B<'30-300>，并表達(dá)純化CsATP-synt B<'30-000>蛋白。該蛋白具有良好的免疫原性，CsATP-synt B在華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)蟲(chóng)體的分布比較廣泛

15、，幾乎遍布整個(gè)蟲(chóng)體，其中腹吸盤、卵巢、卵黃腺和體表的熒光比較強(qiáng)，這四個(gè)部位也是華支睪吸蟲(chóng)能量代謝比較旺盛的器官與組織。CsATP-synt_B在蟲(chóng)體的分布與線粒體的分布較一致。 3．成功構(gòu)建了4個(gè)真核重組質(zhì)粒。pEGFP-N1-CsATP-synt_B<'1-300>在Hela細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞核均有表達(dá)。這個(gè)結(jié)果證實(shí)了這兩段序列是介導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入線粒體和細(xì)胞核的靶向序列，說(shuō)明了理論預(yù)測(cè)的正確性。細(xì)胞經(jīng)過(guò)同步化發(fā)現(xiàn)，融合蛋白是在G

16、l期進(jìn)入細(xì)胞核的，其他細(xì)胞周期時(shí)點(diǎn)主要在線粒體表達(dá)。本課題首次發(fā)現(xiàn)并用實(shí)驗(yàn)證實(shí)CsATP-synt B可以在G<,1>期進(jìn)入細(xì)胞核。 4．細(xì)胞同步化后流式細(xì)胞檢測(cè)，空載體pEGFP-N1在Gd<,0>/G<,1>期表達(dá)量明顯下降，而pEGFP-N1-CsATP-synt_B<'1-300>在這個(gè)時(shí)期表達(dá)量是呈上升的趨勢(shì)。其他細(xì)胞周期時(shí)相，熒光表達(dá)量的變化趨勢(shì)相似。說(shuō)明CsATP-synt_B可以裝配到宿主人的ATP合酶F0復(fù)合體

17、中發(fā)揮它的生物學(xué)作用，說(shuō)明兩者在進(jìn)化中的保守性。 5．在不同的細(xì)胞周期，半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞核后，目的基因CsATP-synt_B<'1-300>及HomoATP-synt B mRNA的表達(dá)均成上升趨勢(shì)，CsATP-synt_B<'1-300>上升幅度較大，但兩者的表達(dá)變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞核是受細(xì)胞能量的需求和細(xì)胞周期的調(diào)控，并且對(duì)自身基因CsATP-synt_B<'1-300>的表達(dá)起正反