桃葉片愈傷組織誘導(dǎo)及遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建.pdf

1、桃是落葉小喬木，果實(shí)味道可口，花極具觀賞性，莖和根可入藥。桃有吉祥長(zhǎng)壽的寓意更受到中國(guó)人民的喜愛(ài)。木本植物的傳統(tǒng)育種至少需要8-10年的時(shí)間，過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間導(dǎo)致育種者的工作量大大增加。生物工程技術(shù)的高速發(fā)展，為園藝產(chǎn)品改良、新種質(zhì)資源的培育和擴(kuò)繁提供契機(jī)。然后，桃樹(shù)的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不成熟，急需開(kāi)展深入研究?；诖耍驹囼?yàn)外植體來(lái)自毛桃、‘秋蜜紅’和‘中油桃14號(hào)’的葉片，通過(guò)不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)不同品種或類(lèi)型桃葉片愈傷組織

2、誘導(dǎo)過(guò)程中愈傷組織形成率和相對(duì)生長(zhǎng)量的比較探究，以期能獲得適宜桃愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基;此外，以毛桃和‘中油桃14號(hào)’葉片為外植體進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，研究影響轉(zhuǎn)化效率的不同菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、乙酰丁香酮濃度和侵染方式等因素，初步建立為后續(xù)桃基因功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)的葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系。主要研究結(jié)果如下:
　　1.桃組培苗的獲得
　　研究表明毛桃、‘秋蜜紅’和‘中油桃14號(hào)’的田間帶頂芽或腋芽莖段，在不同升汞

3、(0.1％)處理時(shí)間后，統(tǒng)計(jì)各品種頂芽和腋芽的萌芽率分別為85.01％和72.88％（毛桃），80.02％和69.02％（‘秋蜜紅’）;84.41％和78.81％（‘中油桃14號(hào)’）。毛桃和‘中油桃14號(hào)’組培苗適宜的初代培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.1mg·L-1+AgNO30.5mg L-1，‘秋蜜紅’組培苗適宜的初代培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg L-1+NAA0.1mg·L-1+AgNO30.5mg·L-

4、1。
　　2.桃葉片愈傷組織的誘導(dǎo)
　　(1)毛桃葉片愈傷組織誘導(dǎo)
　　適合毛桃組培苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg·L-1+2，4-D1.2mg L-1+AgNO30.5mg L-1，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量分別為88.09％和3;毛桃胚培苗葉片愈傷組織再生的最適培養(yǎng)基為MS+AgNO30.5mg·L-1+TDZ1.0mg·L-1+NAA1.5mg·L-1，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對(duì)

5、生長(zhǎng)量分別為69.77％和4。兩種來(lái)源毛桃葉片產(chǎn)生的愈傷組織在最適培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)出黃綠色的愈傷組織，緊實(shí)有突起，這意味著該愈傷組織具備良好的再生能力。
　　(2)‘秋蜜紅’和‘中油桃14號(hào)’組培苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)
　　‘秋蜜紅’組培苗葉片最適誘導(dǎo)愈傷組織再生的培養(yǎng)基是MS+AgNO30.5mg·L-1+TDZ1.0mg·L-1+2，4-D1.2mg·L-1，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量分別為64.55％和4;‘中油

6、桃14號(hào)’組培苗葉片最適誘導(dǎo)愈傷組織再生的培養(yǎng)基是MS+AgNO30.5mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1+2，4-D1.2mg·L-1，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量分別為61.15％和2。
　　三種基因型桃葉片均能誘導(dǎo)出生長(zhǎng)狀態(tài)良好，黃綠色，緊實(shí)有突起，具備良好的再生能力的愈傷組織。但是不同基因型和相同基因型不同來(lái)源的葉片最適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)和農(nóng)低不同。毛桃和‘中油桃14號(hào)’組培苗初代培養(yǎng)

7、和葉片愈傷組織用的培養(yǎng)基一樣，這兩種基因型桃可以進(jìn)行進(jìn)一步的關(guān)聯(lián)研究。
　　3.毛桃和‘中油桃14號(hào)’葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系建立
　　(1)毛桃葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建
　　毛桃組培苗葉片最佳的轉(zhuǎn)化體系是菌液濃度OD600=0.5，采用常規(guī)侵染外植體15min后轉(zhuǎn)入加有乙酰丁香酮20mg·L-1的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)4d，最高的GUS瞬時(shí)表達(dá)率為65.29％;毛桃胚培苗葉片是菌液濃度OD600=0.5，采用抽真空輔助侵染外植體

8、10min后轉(zhuǎn)入加有乙酰丁香酮30mg·L-1的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)2d，最高的GUS瞬時(shí)表達(dá)率為76.45％。兩種來(lái)源毛桃葉片的遺傳轉(zhuǎn)化情況差異明顯，且組培苗葉片的轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于胚培苗葉片轉(zhuǎn)化效果。
　　(2)‘中油桃14號(hào)’組培苗葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系
　　‘中油桃14號(hào)’組培苗葉片最佳的轉(zhuǎn)化體系為菌液濃度OD600=0.5，采用超聲波輔助侵染外植體10min后轉(zhuǎn)入加有乙酰丁香酮40mg·L-1的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3d，最高