桃葉片愈傷組織誘導及遺傳轉(zhuǎn)化體系構建.pdf

1、桃是落葉小喬木，果實味道可口，花極具觀賞性，莖和根可入藥。桃有吉祥長壽的寓意更受到中國人民的喜愛。木本植物的傳統(tǒng)育種至少需要8-10年的時間，過長的時間導致育種者的工作量大大增加。生物工程技術的高速發(fā)展，為園藝產(chǎn)品改良、新種質(zhì)資源的培育和擴繁提供契機。然后，桃樹的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不成熟，急需開展深入研究。基于此，本試驗外植體來自毛桃、‘秋蜜紅’和‘中油桃14號’的葉片，通過不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合對不同品種或類型桃葉片愈傷組織

2、誘導過程中愈傷組織形成率和相對生長量的比較探究，以期能獲得適宜桃愈傷組織的誘導培養(yǎng)基;此外，以毛桃和‘中油桃14號’葉片為外植體進行根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化試驗，研究影響轉(zhuǎn)化效率的不同菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間、乙酰丁香酮濃度和侵染方式等因素，初步建立為后續(xù)桃基因功能驗證奠定基礎的葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系。主要研究結(jié)果如下:
　　1.桃組培苗的獲得
　　研究表明毛桃、‘秋蜜紅’和‘中油桃14號’的田間帶頂芽或腋芽莖段，在不同升汞

3、(0.1％)處理時間后，統(tǒng)計各品種頂芽和腋芽的萌芽率分別為85.01％和72.88％（毛桃），80.02％和69.02％（‘秋蜜紅’）;84.41％和78.81％（‘中油桃14號’）。毛桃和‘中油桃14號’組培苗適宜的初代培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.1mg·L-1+AgNO30.5mg L-1，‘秋蜜紅’組培苗適宜的初代培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg L-1+NAA0.1mg·L-1+AgNO30.5mg·L-

4、1。
　　2.桃葉片愈傷組織的誘導
　　(1)毛桃葉片愈傷組織誘導
　　適合毛桃組培苗葉片愈傷組織誘導的培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg·L-1+2，4-D1.2mg L-1+AgNO30.5mg L-1，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量分別為88.09％和3;毛桃胚培苗葉片愈傷組織再生的最適培養(yǎng)基為MS+AgNO30.5mg·L-1+TDZ1.0mg·L-1+NAA1.5mg·L-1，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對

5、生長量分別為69.77％和4。兩種來源毛桃葉片產(chǎn)生的愈傷組織在最適培養(yǎng)基中均能誘導出黃綠色的愈傷組織，緊實有突起，這意味著該愈傷組織具備良好的再生能力。
　　(2)‘秋蜜紅’和‘中油桃14號’組培苗葉片愈傷組織誘導
　　‘秋蜜紅’組培苗葉片最適誘導愈傷組織再生的培養(yǎng)基是MS+AgNO30.5mg·L-1+TDZ1.0mg·L-1+2，4-D1.2mg·L-1，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量分別為64.55％和4;‘中油

6、桃14號’組培苗葉片最適誘導愈傷組織再生的培養(yǎng)基是MS+AgNO30.5mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1+2，4-D1.2mg·L-1，其愈傷組織形成率和愈傷組織相對生長量分別為61.15％和2。
　　三種基因型桃葉片均能誘導出生長狀態(tài)良好，黃綠色，緊實有突起，具備良好的再生能力的愈傷組織。但是不同基因型和相同基因型不同來源的葉片最適宜的愈傷組織誘導培養(yǎng)基添加的生長調(diào)節(jié)劑種類和農(nóng)低不同。毛桃和‘中油桃14號’組培苗初代培養(yǎng)

7、和葉片愈傷組織用的培養(yǎng)基一樣，這兩種基因型桃可以進行進一步的關聯(lián)研究。
　　3.毛桃和‘中油桃14號’葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系建立
　　(1)毛桃葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系構建
　　毛桃組培苗葉片最佳的轉(zhuǎn)化體系是菌液濃度OD600=0.5，采用常規(guī)侵染外植體15min后轉(zhuǎn)入加有乙酰丁香酮20mg·L-1的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)4d，最高的GUS瞬時表達率為65.29％;毛桃胚培苗葉片是菌液濃度OD600=0.5，采用抽真空輔助侵染外植體

8、10min后轉(zhuǎn)入加有乙酰丁香酮30mg·L-1的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)2d，最高的GUS瞬時表達率為76.45％。兩種來源毛桃葉片的遺傳轉(zhuǎn)化情況差異明顯，且組培苗葉片的轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于胚培苗葉片轉(zhuǎn)化效果。
　　(2)‘中油桃14號’組培苗葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系
　　‘中油桃14號’組培苗葉片最佳的轉(zhuǎn)化體系為菌液濃度OD600=0.5，采用超聲波輔助侵染外植體10min后轉(zhuǎn)入加有乙酰丁香酮40mg·L-1的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3d，最高