鞭毛蛋白在松萎蔫病中的作用機(jī)理研究.pdf

1、為了研究鞭毛蛋白在松萎蔫病中的具體作用,本文首先對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶的熒光假單胞菌(PseudomonasfluorescensGcM5-1A)分泌的鞭毛蛋白對(duì)黑松愈傷組織細(xì)胞的致死方式進(jìn)行研究。結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)鞭毛蛋白處理的黑松愈傷組織細(xì)胞細(xì)胞核解體、基因組DNA發(fā)生降解,但無(wú)明顯的梯形條帶形成,因此推測(cè)鞭毛蛋白對(duì)黑松細(xì)胞的處死方式為非典型性細(xì)胞凋亡。其次,本文還研究了鞭毛蛋白誘導(dǎo)的黑松細(xì)胞死亡對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)及其攜帶的熒光假單胞菌GcM5-1A的

2、繁殖影響,結(jié)果表明,鞭毛蛋白預(yù)處理黑松愈傷組織細(xì)胞再接種松材線(xiàn)蟲(chóng)較正常的愈傷組織細(xì)胞能促進(jìn)松材線(xiàn)蟲(chóng)的繁殖,且在0～9d范圍內(nèi),處理時(shí)間越長(zhǎng)則松材線(xiàn)蟲(chóng)的繁殖速度越快;同時(shí),鞭毛蛋白預(yù)處理的黑松愈傷組織細(xì)胞較正常的愈傷組織對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)攜帶熒光假單胞菌的繁殖也有一定的促進(jìn)作用,用加熱致死黑松愈傷組織分別接種松材線(xiàn)蟲(chóng)及其攜帶的熒光假單胞菌獲得了相似的結(jié)果;將松材線(xiàn)蟲(chóng)直接接種于鞭毛蛋白溶液并培養(yǎng)5d,結(jié)果發(fā)現(xiàn)接入松材線(xiàn)蟲(chóng)的鞭毛蛋白較對(duì)照組明顯減少,

3、條帶無(wú)降解的現(xiàn)象,并且松材線(xiàn)蟲(chóng)的數(shù)量有明顯的增加,推測(cè)可能是松材線(xiàn)蟲(chóng)因攝食了鞭毛蛋白而促進(jìn)其繁殖。上述研究表明,鞭毛蛋白不僅通過(guò)誘導(dǎo)黑松細(xì)胞的死亡對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)及其攜帶致病熒光假單胞菌的繁殖具有一定的促進(jìn)作用,而且鞭毛蛋白本身可以提供松材線(xiàn)蟲(chóng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)而促進(jìn)松材線(xiàn)蟲(chóng)的繁殖,這為松萎蔫病的松材線(xiàn)蟲(chóng)與細(xì)菌復(fù)合致病學(xué)說(shuō)提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 為了進(jìn)一步研究鞭毛蛋白的作用機(jī)理,本文還開(kāi)展了熒光假單胞菌GcM5-1A(P.fluore

4、scensGcM5-1A)鞭毛蛋白基因的克隆與重組表達(dá)的研究,結(jié)果表明,熒光假單胞菌GeM5-1A鞭毛蛋白基因的開(kāi)放讀框全長(zhǎng)1659bp,共編碼552氨基酸殘基。熒光假單胞菌GeM5-1A(P.fluorescensGcM5-1A)鞭毛蛋白基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后克隆到表達(dá)載體pET-15b上,構(gòu)建表達(dá)載體pET-15b-fla。將pET-15b-fla轉(zhuǎn)化EcoliBL21(DE3)構(gòu)建工程菌,IPTG誘導(dǎo)重組鞭毛蛋白在工程菌中的高效表達(dá),