14-3-3蛋白在帕金森病發(fā)病中作用的研究.pdf

1、第一部分、14-3-3蛋白各亞型在大鼠黑質、紋狀體及PC12細胞中的分布
　　 目的：探討14-3-3蛋白各亞型在大鼠黑質、紋狀體以及PC12細胞中的分布情況，為研究14-3-3蛋白在PD發(fā)病中的作用提供形態(tài)學依據(jù)。
　　 方法：本實驗采用了免疫組化/免疫熒光和免疫印跡技術。
　　 結果：免疫組化/免疫熒光結果顯示：在大鼠黑質內，14-3-3蛋白γ、ε、θ、ζ四個亞型免疫反應陽性，而β和η亞型未見明顯免疫反應；在

2、紋狀體，同樣只見γ、ε、θ、ζ四個亞型免疫反應陽性；在PC12細胞中，6個亞型均呈免疫熒光陽性反應；光鏡下顯示，14-3-3蛋白各亞型免疫反應主要位于胞漿，胞核未見明顯陽性著色。Western blot結果顯示在黑質中14-3-3各亞型的表達量分布為ε＞γ＞ζ＞θ；在紋狀體14-3-3各亞型的表達量分布為ε＞γ＞ζ＞θ；在PC12細胞中各亞型的表達量的分布為γ＞ε＞β＞ζ＞η＞θ。
　　 結論：大鼠黑質、紋狀體中存在ε、γ、ζ和

3、θ四種亞型，說明只有這四種亞型可能與PD的發(fā)病有關；同時ε亞型含量最多，提示此亞型可能起主要作用。PC12細胞中含有γ、ε、β、ζ、η和θ六種亞型，且其分布與黑質及紋狀體很相似，因此是研究14-3-3蛋白作用的很好細胞模型。
　　 第二部分、14-3-3蛋白在PD動物模型及細胞模型中表達的變化
　　 目的：觀察14-3-3蛋白在PD大鼠模型黑質中及在MPP+誘導的PC12細胞模型中表達的變化，并探討14-3-3蛋白表達的

4、變化與多巴胺能細胞死亡之間的關系。
　　 方法：①用6-OHDA進行單側中腦黑質立體定位注射，建立偏側PD模型，用阿樸嗎啡誘導大鼠的旋轉行為，檢驗模型的成功。用RT-PCR和Western blot分別在mRNA和蛋白水平檢測14-3-3表達的變化；②用MPP+處理PC12細胞建立PD細胞模型，用western blot檢測MPP+對14-3-3蛋白表達的影響，同時用 MTT法檢測MPP+對PC12細胞活力的影響。
　　

5、 結果：RT①-PCR檢測結果顯示，在6-OHDA誘導的偏側PD大鼠模型中腦黑質中各亞型14-3-3 mRNA的表達無顯著性變化；Western blot顯示免疫反應陽性的四個14-3-3蛋白亞型的蛋白水平均下調。②在MPP+誘導的PC12細胞模型中，14-3-3蛋白的表達隨著MPP+處理的時間延長呈下降趨勢，在6h變化不明顯，12h顯著下降(P<0.05)，到48h后14-3-3蛋白的減少極其顯著(P<0.01)；PC12細胞的存活率

6、也呈現(xiàn)同樣的變化趨勢，在6h變化不明顯，12h顯著下降(P<0.05)，到48h后14-3-3蛋白的減少極其顯著(P<0.01)。
　　 結論：在6-OHDA誘導的PD大鼠模型黑質中，14-3-3 mRNA的表達變化無顯著性差異，而蛋白的水平顯著降低；在MPP+誘導的PD細胞模型中14-3-3蛋白的表達隨著MPP+作用作用時間的延長呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，同樣細胞的存活率也隨著MPP+作用時間延長呈現(xiàn)同樣的下降趨勢，因此我們推測，1

7、4-3-3蛋白水平的降低可能與細胞的死亡相關。
　　 第三部分、含人14-3-3 DNA質粒的構建及穩(wěn)定過表達14-3-3蛋白細胞株的建立
　　 目的：為了建立穩(wěn)定過表達14-3-3蛋白的細胞株，為下一步實驗作準備。
　　 方法：利用基因重組技術先構建真核表達的pcDNA3.1(+)-14-3-3質粒，通過酶切和基因測序驗證所構建的質粒目的基因的正確無誤；然后通過脂質體2000將重組質粒和pEGFP質粒共轉染到P

8、C12 cell，首先觀察轉染效率，然后通過免疫熒光技術和免疫印跡技術檢測轉染質粒攜帶的目的基因在PC12 cell內的表達情況。
　　 結果：酶切鑒定結果顯示，重組質粒組可見兩個酶切條帶，上一個為質粒骨架的條帶，在約900bp處見到的條帶為目的基因的條帶，而空質粒對照組只見一條質粒骨架條帶；測序的結果通過與Genebank所查到的相應基因序列比較完全相符，說明質粒的重組構建成功。將pcDNA3.1(+)-14-3-3質粒和pE

9、GFP質粒共轉染到PC12 cell，通過熒光顯微鏡觀察到，在轉染后24h綠色熒光蛋白開始表達，但發(fā)綠色熒光的細胞比較少，在第2～6d，表達綠色熒光的細胞逐漸增多，而且綠色熒光也越來越強。Western blot結果顯示，pcDNA3.1(+)-14-3-3轉染組14-3-3蛋白的表達與正常對照組和空質粒轉染組相比顯著增加。
　　 結論：成功構建了pcDNA3.1(+)-14-3-3質粒并建立了過表達14-3-3蛋白的細胞株，為

10、下一步實驗做好了準備。
　　 第四部分、14-3-3蛋白的過表達抵抗MPP+對PC12細胞毒性作用的研究
　　 目的：探討14-3-3蛋白過表達對1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導PC12細胞損傷的保護作用
　　 方法 構建pcDNA3.1(+)-14-3-3真核表達質粒，轉染PC12細胞，建立穩(wěn)定過表達14-3-3蛋白細胞株；通過四甲基偶氮唑鹽法(MTT法)、流式細胞術和DAPI凋亡檢測法分別檢測14-

11、3-3蛋白過表達對MPP+誘導的PC12細胞存活力、細胞凋亡和凋亡率的影響。
　　 結果：14-3-3蛋白過表達顯著增加PC12細胞活力(質粒轉染組：0.78±0.06，MPP+組：0.54±0.07)、抑制細胞的凋亡(質粒轉染組：(11.87±3.26)[％]，MPP+組：(36.30±2.39)[％])。
　　 結論：14-3-3蛋白過表達對MPP+的毒性有保護作用。
　　 第五部分、14-3-3蛋白的過表達

12、抵抗MPP+對PC12細胞毒性作用的機制研究
　　 目的：探討14-3-3蛋白過表達對MPP+毒性保護作用的可能機制。
　　 方法：用基因重組技術建立過表達14-3-3蛋白細胞株，用濃度100 μmol/L的MPP+誘導PC12細胞凋亡，建立PD細胞模型，分別采用western blot技術和酶標儀檢測BAD和p-BAD蛋白的表達以及SOD和GSH-Px活性變化情況。
　　 結果：western blot結果顯示

13、MPP+使PC12細胞中BAD蛋白的表達顯著下降；14-3-3蛋白的過表達卻使p-BAD蛋白的表達明顯升高；同時14-3-3蛋白過表達能增加SOD活性(質粒轉染組：9.13±0.41 U/mg，MPP+組：6.45±0.52 U/mg)和GSH-Px活性(質粒轉染組：89.66±3.42 μmol/mg，MPP+組：82.73±4.15 μmol/mg)。
　　 結論：14-3-3蛋白過表達對MPP+的細胞毒性有保護作用，這種作