14-3-3蛋白在帕金森病發(fā)病中作用的研究.pdf

1、第一部分、14-3-3蛋白各亞型在大鼠黑質(zhì)、紋狀體及PC12細(xì)胞中的分布
　　 目的：探討14-3-3蛋白各亞型在大鼠黑質(zhì)、紋狀體以及PC12細(xì)胞中的分布情況，為研究14-3-3蛋白在PD發(fā)病中的作用提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)采用了免疫組化/免疫熒光和免疫印跡技術(shù)。
　　 結(jié)果：免疫組化/免疫熒光結(jié)果顯示：在大鼠黑質(zhì)內(nèi)，14-3-3蛋白γ、ε、θ、ζ四個(gè)亞型免疫反應(yīng)陽性，而β和η亞型未見明顯免疫反應(yīng)；在

2、紋狀體，同樣只見γ、ε、θ、ζ四個(gè)亞型免疫反應(yīng)陽性；在PC12細(xì)胞中，6個(gè)亞型均呈免疫熒光陽性反應(yīng)；光鏡下顯示，14-3-3蛋白各亞型免疫反應(yīng)主要位于胞漿，胞核未見明顯陽性著色。Western blot結(jié)果顯示在黑質(zhì)中14-3-3各亞型的表達(dá)量分布為ε＞γ＞ζ＞θ；在紋狀體14-3-3各亞型的表達(dá)量分布為ε＞γ＞ζ＞θ；在PC12細(xì)胞中各亞型的表達(dá)量的分布為γ＞ε＞β＞ζ＞η＞θ。
　　 結(jié)論：大鼠黑質(zhì)、紋狀體中存在ε、γ、ζ和

3、θ四種亞型，說明只有這四種亞型可能與PD的發(fā)病有關(guān)；同時(shí)ε亞型含量最多，提示此亞型可能起主要作用。PC12細(xì)胞中含有γ、ε、β、ζ、η和θ六種亞型，且其分布與黑質(zhì)及紋狀體很相似，因此是研究14-3-3蛋白作用的很好細(xì)胞模型。
　　 第二部分、14-3-3蛋白在PD動(dòng)物模型及細(xì)胞模型中表達(dá)的變化
　　 目的：觀察14-3-3蛋白在PD大鼠模型黑質(zhì)中及在MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型中表達(dá)的變化，并探討14-3-3蛋白表達(dá)的

4、變化與多巴胺能細(xì)胞死亡之間的關(guān)系。
　　 方法：①用6-OHDA進(jìn)行單側(cè)中腦黑質(zhì)立體定位注射，建立偏側(cè)PD模型，用阿樸嗎啡誘導(dǎo)大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒ΑＳ肦T-PCR和Western blot分別在mRNA和蛋白水平檢測14-3-3表達(dá)的變化；②用MPP+處理PC12細(xì)胞建立PD細(xì)胞模型，用western blot檢測MPP+對14-3-3蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)用 MTT法檢測MPP+對PC12細(xì)胞活力的影響。
　　

5、 結(jié)果：RT①-PCR檢測結(jié)果顯示，在6-OHDA誘導(dǎo)的偏側(cè)PD大鼠模型中腦黑質(zhì)中各亞型14-3-3 mRNA的表達(dá)無顯著性變化；Western blot顯示免疫反應(yīng)陽性的四個(gè)14-3-3蛋白亞型的蛋白水平均下調(diào)。②在MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型中，14-3-3蛋白的表達(dá)隨著MPP+處理的時(shí)間延長呈下降趨勢，在6h變化不明顯，12h顯著下降(P<0.05)，到48h后14-3-3蛋白的減少極其顯著(P<0.01)；PC12細(xì)胞的存活率

6、也呈現(xiàn)同樣的變化趨勢，在6h變化不明顯，12h顯著下降(P<0.05)，到48h后14-3-3蛋白的減少極其顯著(P<0.01)。
　　 結(jié)論：在6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠模型黑質(zhì)中，14-3-3 mRNA的表達(dá)變化無顯著性差異，而蛋白的水平顯著降低；在MPP+誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型中14-3-3蛋白的表達(dá)隨著MPP+作用作用時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，同樣細(xì)胞的存活率也隨著MPP+作用時(shí)間延長呈現(xiàn)同樣的下降趨勢，因此我們推測，1

7、4-3-3蛋白水平的降低可能與細(xì)胞的死亡相關(guān)。
　　 第三部分、含人14-3-3 DNA質(zhì)粒的構(gòu)建及穩(wěn)定過表達(dá)14-3-3蛋白細(xì)胞株的建立
　　 目的：為了建立穩(wěn)定過表達(dá)14-3-3蛋白的細(xì)胞株，為下一步實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備。
　　 方法：利用基因重組技術(shù)先構(gòu)建真核表達(dá)的pcDNA3.1(+)-14-3-3質(zhì)粒，通過酶切和基因測序驗(yàn)證所構(gòu)建的質(zhì)粒目的基因的正確無誤；然后通過脂質(zhì)體2000將重組質(zhì)粒和pEGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到P

8、C12 cell，首先觀察轉(zhuǎn)染效率，然后通過免疫熒光技術(shù)和免疫印跡技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒攜帶的目的基因在PC12 cell內(nèi)的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：酶切鑒定結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組可見兩個(gè)酶切條帶，上一個(gè)為質(zhì)粒骨架的條帶，在約900bp處見到的條帶為目的基因的條帶，而空質(zhì)粒對照組只見一條質(zhì)粒骨架條帶；測序的結(jié)果通過與Genebank所查到的相應(yīng)基因序列比較完全相符，說明質(zhì)粒的重組構(gòu)建成功。將pcDNA3.1(+)-14-3-3質(zhì)粒和pE

9、GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到PC12 cell，通過熒光顯微鏡觀察到，在轉(zhuǎn)染后24h綠色熒光蛋白開始表達(dá)，但發(fā)綠色熒光的細(xì)胞比較少，在第2～6d，表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞逐漸增多，而且綠色熒光也越來越強(qiáng)。Western blot結(jié)果顯示，pcDNA3.1(+)-14-3-3轉(zhuǎn)染組14-3-3蛋白的表達(dá)與正常對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比顯著增加。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-14-3-3質(zhì)粒并建立了過表達(dá)14-3-3蛋白的細(xì)胞株，為

10、下一步實(shí)驗(yàn)做好了準(zhǔn)備。
　　 第四部分、14-3-3蛋白的過表達(dá)抵抗MPP+對PC12細(xì)胞毒性作用的研究
　　 目的：探討14-3-3蛋白過表達(dá)對1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　 方法 構(gòu)建pcDNA3.1(+)-14-3-3真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，建立穩(wěn)定過表達(dá)14-3-3蛋白細(xì)胞株；通過四甲基偶氮唑鹽法(MTT法)、流式細(xì)胞術(shù)和DAPI凋亡檢測法分別檢測14-

11、3-3蛋白過表達(dá)對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活力、細(xì)胞凋亡和凋亡率的影響。
　　 結(jié)果：14-3-3蛋白過表達(dá)顯著增加PC12細(xì)胞活力(質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組：0.78±0.06，MPP+組：0.54±0.07)、抑制細(xì)胞的凋亡(質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組：(11.87±3.26)[％]，MPP+組：(36.30±2.39)[％])。
　　 結(jié)論：14-3-3蛋白過表達(dá)對MPP+的毒性有保護(hù)作用。
　　 第五部分、14-3-3蛋白的過表達(dá)

12、抵抗MPP+對PC12細(xì)胞毒性作用的機(jī)制研究
　　 目的：探討14-3-3蛋白過表達(dá)對MPP+毒性保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　 方法：用基因重組技術(shù)建立過表達(dá)14-3-3蛋白細(xì)胞株，用濃度100 μmol/L的MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，建立PD細(xì)胞模型，分別采用western blot技術(shù)和酶標(biāo)儀檢測BAD和p-BAD蛋白的表達(dá)以及SOD和GSH-Px活性變化情況。
　　 結(jié)果：western blot結(jié)果顯示

13、MPP+使PC12細(xì)胞中BAD蛋白的表達(dá)顯著下降；14-3-3蛋白的過表達(dá)卻使p-BAD蛋白的表達(dá)明顯升高；同時(shí)14-3-3蛋白過表達(dá)能增加SOD活性(質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組：9.13±0.41 U/mg，MPP+組：6.45±0.52 U/mg)和GSH-Px活性(質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組：89.66±3.42 μmol/mg，MPP+組：82.73±4.15 μmol/mg)。
　　 結(jié)論：14-3-3蛋白過表達(dá)對MPP+的細(xì)胞毒性有保護(hù)作用，這種作